甘加型藏羊发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴中ERβ mRNA及其蛋白的表达

包莹莹，陈卫刚，葛闻博，何玉琴，*，杨志杰，周凯仁，杨大鹏，杨亚文，刘莉莉

(1.甘肃农业大学 生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

雌激素主要由卵巢分泌，通过与哺乳动物下丘脑-垂体-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian axis， HPO)轴中雌激素受体(estrogen receptor， ER)结合对动物的生殖活动发挥着重要的调控作用。经典的雌激素受体包括ERα和ERβ两种亚型，都属于核受体蛋白超家族中的成员。有研究表明，敲除ERβ基因的雌性小鼠生育能力明显减弱，说明ERβ是雌性生殖能力调节的重要因素。甘加型藏羊是甘南草地型藏羊的优良地方品种之一，典型的季节性发情动物，每年7—9月发情，1年产羔1次，多单胎，繁殖率低。已有研究表明，ERβ在小鼠下丘脑、大鼠垂体及卵巢、山羊垂体等器官中均有表达，但有关ERβ在甘加型藏羊发情周期HPO轴中的表达鲜有报道。因此，本文以甘加型藏羊为研究对象，运用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学法分别检测mRNA及其蛋白在其发情周期HPO轴中的表达和分布，以期探讨ERβ对甘加型藏羊发情周期的影响，并进一步研究生殖相关激素受体对其繁殖的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物与样品采集

于2019年8月到甘肃省甘南州夏河县甘加乡藏羊养殖场选取32只2.5～3.5岁健康且未孕的雌性甘加型藏羊，根据公羊爬跨试情，参照余四九四期分法将发情周期分为发情前期(第14天早上～16天晚上)、发情期(第0～36 h)、发情后期(第39～72 h)及间情期(第4天早上～13天晚上)4组，每组8只羊，正常饲养。监测至发情周期各时期中间，处死(颈动脉放血法)试验羊，迅速采取下丘脑、垂体及卵巢，将器官等体积分为两半，一半迅速置于液氮中，带回实验室-80 ℃冰柜保存备用，另一半0.9%NaCl溶液稍洗置于4%多聚甲醛溶液固定。

1.2 试验仪器与试剂

1.2.1 试验仪器

切片机(上海，科达)，光学显微镜(厦门，麦克奥迪)，荧光定量PCR仪(美国，罗氏)，蛋白电泳装置(美国，伯乐)，101型电热鼓风干燥箱(北京，科伟)。

1.2.2 试验试剂

链霉卵白素染色试剂盒(Streptavidin/Peroxidase)、DAB、ERβ一抗、二抗等均购自北京博奥森生物技术有限公司；TransZol Up、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、蛋白裂解液等均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 ERβ mRNA荧光定量PCR

根据RNA提取试剂盒说明书分别提取甘加型藏羊发情周期下丘脑、垂体、卵巢中的总RNA，并按反转录试剂盒说明书以20 μL体系反转录成cDNA保存备用。

根据NCBI中已有的绵羊和-mRNA序列设计引物(Primer Premier5.0)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。以反转录的cDNA为模板，按TranScriptTip Green qPCR SuperMix说明，20 μL体系三步法进行。反应条件：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，45个循环；72 ℃延伸10 s。每个样品做3 次重复。

1.4 Western blot检测

表1 引物信息

分别将下丘脑、垂体、卵巢在液氮中充分研磨后各称取100 mg研磨液，加入蛋白裂解液，冰上充分裂解后4 ℃ 12 000 ×离心5 min，取上清液，按3∶1与4×上样缓冲液混合，98 ℃水浴变性后-20 ℃保存备用。

配制5%的浓缩胶和12%的分离胶，每孔加8 μL蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后对照Marker预染条带切取ERβ(58 ku)和β-actin(42 ku)对应胶条，湿转法将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，PBST(PBS+tween 20)溶液充分洗膜后用5%脱脂奶粉封闭20 min，加入，ERβ一抗稀释液(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，PBST洗膜4 h，再加二抗稀释液(1∶3 000)37 ℃水浴1 h，PBST洗膜2 h后暗室曝光。

1.5 免疫组织化学染色

将固定好的器官包埋制作4 μm厚石蜡切片，常规脱蜡处理后微波法抗原修复10 min， 再用3% HO湿盒37 ℃孵育15 min，之后正常山羊血清工作液(A液)37 ℃封闭15 min，ERβ一抗稀释液(1∶800)4 ℃孵育过夜后37 ℃孵育2 h，然后用生物素标记的二抗(B液)37 ℃孵育15 min，再用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素亲和工作液(C液)37 ℃孵育15 min。每次孵育后均用PBS(0.01 mol·L，pH 7.4)洗涤3次，每次5 min。DAB显色7 min，苏木精复染3 min，返蓝，脱水透明后中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余条件和步骤都相同。

1.6 数据统计

荧光定量PCR(qRT-PCR)结果按2法计算发情周期不同阶段各组织基因相对表达量；Western blot结果用Image J软件分析胶条灰度值。所有数据均以“平均值±标准误”表示，统计学差异用SPSS19.0进行单因素方差分析，值<0.05为差异显著。免疫组织化学染色结果用Motic SK210型光学显微镜观察拍照。

2 结果与分析

2.1 ERβ mRNA在甘加型藏羊发情周期HPO轴中的表达变化

qRT-PCR结果(图1)显示，mRNA相对表达量在甘加型藏羊发情周期下丘脑中发情前期最高，显著高于其他3个时期(<0.05)，发情期与发情后期差异不显著(>0.05)；垂体中发情前期最高，显著高于其他3个时期(<0.05)，发情期次之，发情后期最低，与间情期差异不显著(>0.05)。卵巢中间情期表达量显著高于其他3个时期(<0.05)。

2.2 ERβ蛋白在甘加型藏羊发情周期HPO轴中的表达变化

Western blot 分析(图2)发现，ERβ蛋白在下丘脑中发情前期表达量最高，其次为发情后期、发情期，间情期最低，发情后期与间情期差异不显著(>0.05)，其他各个时期差异显著(<0.05)；垂体中发情前期表达最高，之后开始降低，到间情期达最低，间情期与其他3个时期表达差异显著(<0.05)；卵巢中发情前期最低，间情期最高，显著高于其他3个时期(<0.05)，发情前期和发情期差异不显著(>0.05)。

2.3 ERβ阳性产物在甘加型藏羊发情周期HPO轴中的分布

甘加型藏羊发情周期HPO轴免疫组织化学结果(图3)显示，ERβ阳性产物为黄色或棕黄色，所有阴性对照组试验结果均为阴性，证明试验所选用的ERβ一抗具有特异性。

对甘加型藏羊发情周期下丘脑、垂体及卵巢免疫组化染色分析发现，ERβ阳性产物在下丘脑促垂体区大神经元胞体及轴突分布(图3 A-D)；垂体(图3 F-I)中主要分布在远侧部和中间部嗜酸性细胞胞浆中，胞核有微弱表达；卵巢(图3 K-N)中在生长卵泡颗粒细胞胞浆和胞核、卵泡内膜细胞及黄体细胞胞浆中分布。

A，下丘脑；B，垂体；C，卵巢。没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。A， Hypothalamic；B， Pituitary；C， Ovarian. PE， Proestrus; E， Estrus; ME， Metestrus; DE， Diestrus. The different lowercase indicated significant difference (P<0.05). The same as below.图1 甘加型藏羊发情周期HPO轴中ERβ mRNA相对表达量Fig.1 Relative expression levels of ERβ mRNA in HPO axis of Ganjia Tibetan sheep during the estrus cycle

图2 甘加型藏羊发情周期HPO轴中ERβ蛋白相对表达量Fig.2 Relative expression levels of ERβ protein in in HPO axis of Ganjia Tibetan sheep during the estrus cycle

3 讨论

3.1 ERβ在下丘脑中的表达及分布

雌性哺乳动物的生殖生理活动受下丘脑-垂体-卵巢轴的调控，且有多种激素及其他因子协调作用，其中下丘脑(gonadotrophin-releasing hormone， GnRH)的脉冲式分泌是激活动物发情周期的关键点，而GnRH的分泌受雌激素的反馈调节影响。卵巢分泌的雌激素可以随血液循环到达靶器官与其受体结合发挥作用。研究表明，发情周期中，雌激素可通过正、负反馈作用调节卵巢、下丘脑和垂体激素的分泌，从而影响动物生殖活动。有研究发现，ERβ在中枢神经系统的不同区域、卵巢及雄性生殖器中有较高表达。在大鼠和小鼠下丘脑室旁核内均可见ERβ免疫阳性反应。本研究结果表明，ERβ免疫阳性产物主要在下丘脑促垂体区大神经元胞体及轴突中表达，mRNA及蛋白在发情前期相对表达量最高，之后逐渐减少，到间情期达最低。ERβ在甘加型藏羊发情周期下丘脑中的这种动态差异表达说明其参与藏羊发情周期的调控。据Maeda等报道，雌激素的反馈作用是借Kisspeptin/GPR54信号系统实现的。雌性绵羊下丘脑弓状核中Kisspeptin神经元介导了雌激素对GnRH和促黄体生成素(luteinizing hormone， LH)释放的负反馈作用。弓状核中Kisspeptin神经元能与GnRH细胞直接接触，这些细胞将雌激素的正、负反馈效应传递给GnRH神经元，从而调控季节性繁殖及发情周期等繁殖活动。

A、F、K，发情前期；B、G、L，发情期；C、H、M，发情后期；D、I、N，间情期；E、J、O，阴性对照。GC，神经胶质细胞；NC，神经元；Nu，神经细胞核；AC，嗜酸性细胞；BC，嗜碱性细胞；CC，嫌色细胞；PD，远侧部；PI，中间部；FA，卵泡腔；GV，卵母细胞核；LC，黄体细胞；TF，卵泡膜；SG，颗粒层。A， F， K， Proestrus; B， G，L， Estrus; C， H，M， Metestrus; D，I，N， Diestrus; E，J，O， Negative control. GC， Glial cell; NC， Nerve cell; Nu， Neuronuclei; AC， Acidophilic cell; BC， Basophilic cell; CC， Chromophobe cell; PD， Pars distalis; PI， Pars intermedie; FA， Follicular antrum; GV， Germinal vesicle; LC， Luteal cell; TF， Theca folliculi; SG， Stratum granulosum.图3 甘加型藏羊发情周期HPO轴ERβ阳性反应分布Fig.3 The location of positive reaction of ERβ in HPO axis of Ganjia Tibetan sheep during the estrus cycle

3.2 ERβ在垂体中的表达及分布

垂体是机体内重要的内分泌腺，控制着动物的生长、发育、代谢、生殖等重要的生命活动。垂体由腺垂体和神经垂体两大部分组成，其中腺垂体是最主要的部分。性腺分泌的雌激素以内分泌方式，下丘脑等脑部器官及垂体自身合成的雌激素以旁分泌或自分泌方式作用于腺垂体，使腺垂体卵泡刺激素(follicle stimulating hormone， FSH)和LH的分泌受到影响，进而影响卵巢性激素的合成与分泌，参与调控动物的生殖生理活动。研究表明，只有当足够高的E信号或增加的E持续几个小时时才会引起LH/GnRH激增，进而诱导ER、GnRHR等的表达。有学者发现ERβ蛋白存在于大鼠垂体前叶和整个大脑，包括负责调节促性腺激素释放激素合成和分泌的区域。本试验结果表明，ERβ蛋白在甘加型藏羊发情周期垂体远侧部和中间部表达，虽然是核受体，但在胞浆高表达，且mRNA及其蛋白在发情前期表达最高，间情期最低，提示ERβ可能主要在腺垂体细胞胞浆中发挥其调控发情周期的作用。

3.3 ERβ在卵巢中的表达及分布

卵巢作为主要的雌性生殖器官，兼有外分泌(产生并排出卵子)和内分泌(分泌雌激素和孕酮)的双重功能，在雌性生殖中占主导作用。免疫组织化学研究表明，ERβ免疫阳性产物广泛存在于卵巢生长卵泡颗粒细胞胞浆和胞核、卵泡内膜细胞及黄体细胞胞浆中，这与郑可佳等的研究结果一致。基因敲除鼠性成熟后表现出不孕不育，研究发现，突变大鼠的不孕症和突变小鼠的不育与卵巢雌激素的分泌中断有关，卵巢颗粒细胞表达ERβ，ERβ的缺失会导致颗粒细胞对促性腺激素的反应性降低，并抑制卵泡成熟。此外，ERβ的破坏可能对颗粒细胞内促性腺激素驱动的细胞内信号通路产生抑制作用。笔者发现，甘加型藏羊发情周期卵巢中mRNA及其蛋白在间情期表达最高，此时新一轮发情周期的黄体已经完全发育成熟，大量分泌雌激素和孕酮，雌激素与ERβ结合发挥其影响动物发情、排卵等生殖活动的功能。

3.4 雌激素受体与动物繁殖的关系

近年来，雌激素受体在动物繁殖力调控的研究受国内外学者广泛关注。在小鼠中，基因的缺失会使卵巢出现血性卵泡或囊肿性卵泡，甚至导致雌性不育，基因的缺失导致卵巢缺陷，卵泡数量明显减少以及排卵受到抑制，繁殖率降低。结合我们先前的研究结果，和基因及其蛋白在甘加型藏羊发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴中均有表达，但二者的表达存在差异性:下丘脑中ERα在发情后期表达量最高，垂体中在发情期最高，卵巢中在发情前期最高；而ERβ在下丘脑和垂体中均在发情前期表达量最高，在卵巢中间情期最高，且垂体中ERβ的表达量高于ERα，但卵巢中又以ERα为优势表达，说明雌激素在甘加型藏羊发情周期不同阶段、不同器官中与ERα和ERβ结合能力不同，故推测ERα和ERβ在动物繁殖活动中担任不同的角色，其具体机制有待进一步研究。

4 结论

本研究结果显示，ERβ在甘加型藏羊发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴中均有分布，其mRNA和蛋白在下丘脑中和垂体中发情前期表达量最高，在卵巢中间情期表达最高，ERβ的这种动态差异表达，提示ERβ在甘加型藏羊发情周期不同阶段中具有重要的生物学作用。推测ERβ可能通过影响下丘脑GnRH、垂体FSH和LH及卵巢雌激素和孕酮等生殖相关激素分泌水平的变化，进而调控发情周期及卵泡的生长发育等生殖活动，但相关机制有待深入研究。