苯异噁唑基莽草酰胺衍生物的合成与体外抗乙肝病毒活性研究

杨冬, 梁正诚, 谢梓悦, 韦万兴, 梁桃源, 王勉

(广西大学 化学化工学院, 广西 南宁 530004)

0 引言

乙型肝炎是一种全球性传染病,约有超过3.5亿人是慢性乙肝病毒感染者。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是一种包膜 DNA 病毒,它感染肝脏后,会引起肝细胞坏死和炎症,严重的将导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌,每年造成约60万人死亡[1]。我国乙肝病毒携带者约占全球的45%,约1.2亿人,是乙肝表面抗原携带人数最多的国家[2]。目前,2种以皮下干扰素(interferon,IFN)为基础的药物和7种口服核苷类似物(nucleoside analogue，NUC)已被批准用于慢性乙型肝炎的治疗。干扰素需皮下注射，并且耐受性差和具有显著的副作用,因此使用一直受到限制。NUCs可以抑制HBV DNA,但对HBV感染肝细胞的cccDNA没有直接作用,因此通常需要长期持续NUCs治疗以维持病毒学应答。终身NUC治疗的经济问题和耐药性等问题可能会使病情随着治疗时间的延长而恶化[3]。为了进一步提高抗HBV治疗水平,迫切需要开发新的抗HBV药物。

异噁唑是含有一个氮原子和一个氧原子的五元杂环化合物,广泛存在于天然产物之中。研究表明，这类化合物具有很多很好的生物活性,在抗糖尿病、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等方面起到很大作用。另外,一些异噁唑衍生物能够抑制杂草和土壤细菌,因此在农药和杀虫剂领域也有着广泛应用[4-6]。由于异噁唑环的合成相对容易,且异噁唑衍生物通常具有较低的细胞毒性,因此它们仍是开发具有不同生物活性的新化合物的流行骨架结构。

莽草酸是植物和微生物的生物过程中一种极其重要的天然产物,主要用于工业合成抗流感病毒药物奥司他韦[7]。实验表明莽草酸通过影响花生四烯酸代谢,抑制血小板聚集,抑制动、静脉血栓及脑血栓形成,具有抗菌、抗肿瘤、抗禽流感的作用[8]。莽草酸还因其特有的碳主链和固有的手性结构在有机合成中作为一种多用途的手性前体得到广泛应用[9]，因此莽草酸在合成新的化学药物、开发新的生物活性等方面具有广阔的应用前景[10]。本文以莽草酸为原料,经酰胺化、肟化、环加成反应等过程得到22个未见报道的化合物，并用1H NMR、13C NMR和MS对其化学结构进行表征,同时,以HepG 2.2.15细胞株为模型,测试22个化合物的体外抗乙肝病毒活性,并对结果进行分析，旨在为抗乙肝病毒药物的发展提供一定的理论依据。

1 实验

1.1 仪器与试剂

核磁共振仪(AVANCE Ⅲ HD500)；Thermo Scientific ITQ 1100 质谱仪(Thermo Fisher)；Elx800型酶联免疫检测仪(美国BIO-TEK公司)；WRX-4显微熔点仪(上海易测仪器设备有限公司)；莽草酸(上海泰坦科技股份有限公司)；炔丙基胺(上海泰坦科技股份有限公司)；4-二甲氨基吡啶(DMAP)(上海泰坦科技股份有限公司)；1-羟基苯并三唑(HOBt)(上海泰坦科技股份有限公司)；N-氯代丁二酰亚胺(NCS)(上海泰坦科技股份有限公司)；1,1-羰基二咪唑(CDI)(上海泰坦科技股份有限公司)；盐酸羟胺(上海泰坦科技股份有限公司)；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)(上海泰坦科技股份有限公司)；薄层色谱硅胶(青岛海洋化工有限公司)；胎牛血清(Gibco公司)；HBsAg、HBeAg试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)；拉米夫定(3TC,葛兰素史克制药有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 化合物的合成

莽草酸合成莽草酰炔-烯丙胺,然后与各种醛形成的氧化氰反应,得到苯异噁唑基莽草酰胺类衍生物。合成方法如图1、2所示。

试剂与条件:(a)乙酸酐,浓硫酸,75 ℃,5 h；(b) HOBt,DMAP, 炔丙基胺,室温，24 h; (c) CDI, EDC·HCL, 烯丙基胺盐酸盐,室温，24 h; (d)氨水,甲醇,室温，5 h。

试剂与条件:(e) NaHCO3,N2,室温，4 h; (f) 盐酸羟胺,NaCO3,室温，5h;(g) NCS,室温，5 h。

1.2.1 莽草酰炔/烯丙胺合成

在100 mL反应瓶中,加入10 mmol莽草酸、25 mL乙酸酐溶液,室温搅拌条件下加入23 μL浓硫酸。反应升温至75 ℃,在75 ℃下搅拌5～6 h。薄层色谱检测反应完成后降至室温。用30 mL 二氯甲烷萃取3次,30 mL饱和食盐水溶液洗涤3次,无水硫酸钠干燥,减压蒸干备用。得化合物Ⅰ1(产率约95%)[11]。

化合物Ⅰ1：1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：6.73 (d,J= 3.7 Hz, 1H,H-6), 5.76 (d,J= 4.0 Hz, 1H,H-1), 5.33 (dd,J= 8.1, 4.1 Hz, 1H,H-3), 5.30-5.25 (m, 1H,H-2), 2.92 (dd,J= 18.5, 5.2 Hz, 1H,H-4), 2.50 (dd,J= 18.5, 5.8 Hz, 1H,H-4), 2.20 (s,6H,H-9,13), 2.17 (s,3H,H-17)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ:176.30-166.60 (m)(C-8,12,16), 166.87 (C-19), 132.71 (C-5), 130.86 (C-6), 67.40 (C-2), 66.61 (C-3), 65.85 (C-1), 28.31 (C-4), 20.77 (C-9), 20.57 (d)(C-13,17)。

在100 mL反应瓶中,加入10 mmol Ⅰ1、11 mmol HOBt、2 mmol DMAP、11 mmol的炔丙基胺、50 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液,室温搅拌24 h。薄层色谱检测反应完成后,用30 mL乙酸乙酯萃取3次,30 mL饱和食盐水溶液洗涤3次,无水硫酸钠干燥,减压蒸干备用。经硅胶柱层析分离提纯[V(乙酸乙酯)∶V(石油醚) =1∶2]。得化合物Ⅰ2(产率约78%)[12]。

在100 mL反应瓶中,加入10 mmol Ⅰ1,11 mmol CDI,15 mmol EDC·HCL,15 mmol烯丙基胺盐酸盐,50 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液,室温搅拌24 h。薄层色谱检测反应完成后,用100 mL乙酸乙酯萃取3次,30 mL饱和食盐水溶液洗涤3次,无水硫酸钠干燥,减压蒸干备用。经硅胶柱层析分离提纯[V(乙酸乙酯)∶V(石油醚) =1∶2],得化合物Ⅰ3(产率约65%)[13]。

化合物Ⅰ3：1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.24 (t,J= 5.8 Hz, 1H,H-20), 6.42～6.16 (m, 1H,H-6), 5.74 (ddt,J= 17.2, 10.5, 5.3 Hz, 1H,H-23), 5.53 (t,J=3.9 Hz, 1H,H-1), 5.10～5.07 (m, 1H,H-2,3), 5.03 (m,1H,H-24), 5.01～4.97 (m, 1H,H-24)，3.80～3.57 (m, 2H,H-22), 2.80～2.73 (m, 1H,H-4), 2.35～2.29 (m, 1H,H-4), 2.01～1.92 (m, 9H,H-10,14,18)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：169.98～169.50 (m)(C-9,13,17), 165.44 (C-7), 135.13 (C-5), 135.02 (C-6), 125.75 (C-23), 115.34 (C-24), 67.76 (C-2), 66.52 (C-3), 65.84 (C-1), 41.36 (C-22), 28.59 (C-4), 20.75(C-10), 20.59～20.54 (d)(C-14,18)。

在50 mL反应瓶中,加入10 mmol化合物Ⅰ2(或Ⅰ3)、5 mL氨水、20 mL甲醇溶液。室温搅拌5 h。薄层色谱检测反应完成后,减压蒸干备用。得化合物Ⅰ4(或Ⅰ5)(产率约98%)[14]。

化合物Ⅰ4：1H NMR (500 MHz, Chloroform-d4),δ：7.93 (t,J= 5.7 Hz, 1H,H-8), 6.21-5.90 (m, 1H,H-6), 4.06 (s, 3H,H-13,14,15), 3.86 (dt,J= 3.8, 2.0 Hz, 1H,H-1), 3.54 (dt,J= 5.4, 2.5 Hz, 2H,H-10), 3.50 (dt,J= 6.7, 4.7 Hz, 1H,H-3), 3.19 (dd,J= 6.6, 4.0 Hz, 1H,H-2), 2.64 (t,J= 2.5 Hz, 1H,H-12), 2.15 (ddd,J= 19.9, 4.7, 2.2 Hz, 1H,H-4), 1.66 (dt,J= 17.7, 3.0 Hz, 1H,H-4)。

化合物Ⅰ5：1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.22 (t,J= 5.8 Hz, 1H,H-8), 6.50 (d,J= 3.4 Hz, 1H,H-6), 5.96 (ddt,J= 17.3, 10.4, 5.2 Hz, 1H,H-11), 5.29～5.15 (m, 2H,H-12), 4.95 (s, 2H,H-13,14), 4.37 (s, 1H,H-15), 4.00 (dd,J= 8.1, 3.7 Hz, 1H,H-1), 3.89 (d,J= 5.4 Hz, 3H,H-3,10), 3.69 (dd,J= 7.0, 4.0 Hz, 1H,H-2), 2.75～2.63 (m, 1H,H-4), 2.18 (dd,J= 17.9, 5.0 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：167.31 (C-7), 135.64 (C-5), 132.54 (C-6), 131.78 (C-11), 115.13 (C-12), 71.14 (C-1), 66.85 (C-2), 65.76 (C-3), 41.37 (C-10), 30.83 (C-4)。

1.2.2 取代苯甲醛肟的合成

在100 mL反应瓶中,加入5 mmol苯甲醛、7.5 mmol盐酸羟胺、15 mmol 碳酸钠、25 mL水、25 mL乙醇。室温搅拌5 h。薄层色谱检测反应完成后,用稀盐酸中和至中性偏碱性,100 mL乙酸乙酯萃取,50 mL饱和食盐水溶液洗涤3次,无水硫酸钠干燥,减压蒸干备用。得化合物Ⅰ6(产率约98%)[15]。

1.2.3 目标化合物苯异噁唑基莽草酰胺的制备

在50 mL反应瓶中,加入5 mmol Ⅰ6、20 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液,在冰浴条件将10 mmol NCS分5次加入,每次间隔2 min,薄层色谱检测反应完成[16]。升至室温,加入5 mmol化合物Ⅰ4(或Ⅰ5)和6 mmol NaHCO3。氮气保护下室温搅拌4 h。薄层色谱检测反应完成后,减压蒸干溶剂,经硅胶柱层析分离提纯[V(甲醇)∶V(二氯甲烷) =1∶2],得目标化合物1,2,3，…，22。

化合物1：3,4,5-三羟基-N-((3-苯基异噁唑-5-基)甲基)环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体 (270.1 mg, 产率82% ),熔点: 129～131 °C；1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.56 (t,J= 5.8 Hz, 1H,H-11), 7.85 (dd,J= 6.5, 3.2 Hz, 2H,H-20,24), 7.49 (dd,J= 5.1, 2.0 Hz, 3H,H-21,22,23), 6.82 (s, 1H,H-15), 6.40 (d,J= 2.6 Hz, 1H,H-6), 4.79 (d,J= 3.8 Hz, 1H,H-8), 4.71 (d,J= 6.9 Hz, 1H,H-7), 4.56 (d,J= 4.4 Hz, 1H,H-9), 4.48 (dd,J= 5.8, 2.7 Hz, 2H,H-13), 4.20 (dt,J= 5.6, 3.0 Hz, 1H,H-1), 3.84 (ddd,J= 8.4, 5.1, 3.2 Hz, 1H,H-3), 3.58～3.47 (m, 1H,H-2), 2.59～2.50 (m, 1H,H-4), 2.08-1.98 (m, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：171.16 (C-10), 167.06 (C-16), 161.62 (C-14), 133.33 (C-6), 130.71 (C-5), 129.99 (C-22), 128.92 (C-19), 128.42 (C-21,23), 126.40 (C-20,24), 99.74 (C-15), 70.53 (C-1), 66.60 (C-2), 65.38 (C-3), 34.82 (C-13), 30.13 (C-4)。HR-ESI-MS: C17H18N2O5[M+H]+,理论值为331.128 8,实测值为331.128 8。

化合物2：3,4,5-三羟基-N-((3-(对甲苯基)异噁唑-5-基)甲基)环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(285.6 mg, 产率83%),熔点: 126～128 °C；1H NMR (500 MHz,DMSO-d6),δ：8.55 (t,J= 5.8 Hz,1H,H-11), 7.74 (d,J= 8.1 Hz, 2H,H-20,24), 7.29 (d,J= 8.0 Hz, 2H,H-21,23), 6.77 (s, 1H,H-15), 6.47～6.31 (m, 1H,H-6), 4.79 (d,J= 3.8 Hz, 1H,H-8), 4.71 (d,J= 6.9 Hz, 1H,H-7), 4.55 (d,J= 4.4 Hz, 1H,H-9), 4.46 (dd,J= 5.8, 2.8 Hz, 2H,H-13), 4.20 (dq,J= 5.2, 2.4 Hz, 1H,H-1), 3.84 (dq,J= 8.3, 4.5 Hz, 1H,H-3), 3.52 (dt,J= 7.1, 4.0 Hz, 1H,H-2), 2.55～2.50 (m, 1H,H-4), 2.34 (s, 3H,H-25), 2.04 (ddt,J= 17.7, 4.6, 1.7 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：170.96 (C-10), 167.05 (C-16), 161.51 (C-14), 139.67 (C-6), 133.31 (C-5), 130.72 (C-22), 129.47 (C-21,23), 126.31 (C-20,24), 125.62 (C-19), 99.61 (C-15), 70.54 (C-1), 66.60 (C-2), 65.38 (C-3), 34.81 (C-13), 30.13 (C-4), 20.79 (C-25)。HR-ESI-MS: C18H20N2O5[M+H]+,理论值为345.144 4,实测值为345.144 4。

化合物3：3,4,5-三羟基-N-((3-(4-异丙基苯基)异噁唑-5-基)甲基)环己-1烯-1-甲酰胺, 白色固体(301.5 mg, 产率81% ), 熔点: 135～137 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.50 (t,J= 5.8 Hz, 1H,H-11), 7.69 (d,J= 8.3 Hz, 2H,H-20,24), 7.28 (d,J= 8.3 Hz, 2H,H-21,23), 6.71 (s, 1H,H-15), 6.36～6.33 (m, 1H,H-6), 4.75 (d,J= 3.8 Hz, 1H,H-8), 4.67 (d,J= 6.9 Hz, 1H,H-7), 4.51 (d,J= 4.4 Hz, 1H,H-9), 4.41 (dd,J= 6.0, 2.8 Hz, 2H,H-13), 4.15 (s, 1H,H-1), 3.79 (dd,J= 6.7, 4.0 Hz, 1H,H-3), 3.49-3.46 (m, 1H,H-2), 2.85 (p,J= 6.9 Hz, 1H,H-25), 2.47 (ddd,J= 15.8, 4.8, 2.4 Hz, 1H,H-4), 2.02-1.96 (m, 1H,H-4), 1.14 (d,J= 6.9 Hz, 6H,H-26,27)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：171.14 (C-10), 167.31 (C-16), 161.76 (C-14), 150.65 (C22), 133.54 (C-6), 130.96 (C-5), 127.06 (C-21,23), 126.66 (C-20,24), 126.23 (C-19), 99.87 (C-15), 70.76 (C-1), 66.83 (C-2), 65.61 (C-3), 35.03 (C-13), 33.37 (C-25), 30.37 (C-4), 23.71 (C-26,27)。HR-ESI-MS: C20H24N2O5[M+H]+,理论值为373.175 7,实测值为373.175 7。

化合物4：N-((3-(4-(叔丁基)苯基)异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺,白色固体(332.1 mg, 产率86%), 熔点: 127～129 °C;1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ：7.74 (d,J= 8.4 Hz, 2H,H-20,24), 7.52 (d,J= 8.5 Hz, 2H,H-21,23), 6.67 (s, 1H,H-15), 6.53 (dt,J= 3.8, 1.8 Hz, 1H,H-6), 4.60 (d,J= 1.1 Hz, 2H,H-13), 4.39 (td,J= 3.9, 1.9 Hz, 1H,H-1), 4.03 (dt,J= 7.5, 5.4 Hz, 1H,H-3), 3.70 (dd,J= 7.6, 4.2 Hz, 1H,H-2), 2.79 (ddt,J= 17.8, 5.1, 1.7 Hz, 1H,H-4), 2.23 (ddt,J= 17.8, 5.8, 1.7 Hz, 1H,H-4), 1.35 (s, 9H,H-26,27,28)。13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ：171.77 (C-10), 170.27 (C-16), 163.80 (C-14), 154.72 (C-22), 133.90 (C-6), 133.43 (C-5), 127.55 (C-21,23), 127.23 (C-19), 126.98 (C-20,24), 101.11 (C-15), 72.84 (C-1), 68.33 (C-2), 67.34 (C-3), 36.32 (C-13), 35.67 (C-25), 31.82 (C-4), 31.59 (C-26,27,28)。HR-ESI-MS: C21H26N2O5[M+H]+,理论值为387.191 4,实测值为387.191 4。

化合物5：N-((3-(4-氟苯基)异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(275.0 mg, 产率79% ), 熔点: 155～157 °C;1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ：7.10-6.97 (m, 2H,H-20,24), 6.40 (t,J= 8.8 Hz, 2H,H-21,23), 5.87 (s, 1H,H-15), 5.74-5.66 (m, 1H,H-6), 3.79 (s, 2H,H-13), 3.65-3.48 (m, 1H,H-1), 3.21 (dt,J= 7.6, 5.4 Hz, 1H,H-3), 2.88 (dd,J= 7.5, 4.2 Hz, 1H,H-2), 1.96 (ddt,J= 17.9, 5.0, 1.8 Hz, 1H,H-4), 1.41 (ddt,J= 17.8, 5.8, 1.7 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ：171.79 (C-10), 169.95 (C-16), 164.95 (d,J= 248.7 Hz, C-22), 162.64 (C-14), 133.60 (C-6), 133.06 (C-5), 129.65 (d,J= 8.4 Hz, C-20,24), 126.29 (d,J= 3.3 Hz, C-19), 116.63 (d,J= 22.2 Hz, C-21,23), 100.73 (C-15), 72.50 (C-1), 68.00 (C-2), 67.00 (C-3), 35.99 (C-13), 31.46 (C-4)。19F NMR (471 MHz, DMSO-d6),δ：-110.80.HR-ESI-MS: C17H17FN2O5[M+H]+,理论值为349.119 4,实测值为349.119 4。

化合物6：N-((3-(4-氯苯基)异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(269.4 mg, 产率74%),熔点:124～126 °C；1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.57 (t,J= 5.8 Hz, 1H,H-11), 7.90 (d,J= 8.5 Hz, 2H,H-20,24), 7.57 (d,J= 8.6 Hz, 2H,H-21,23), 6.87 (s, 1H,H-15), 6.40 (d,J= 2.8 Hz, 1H,H-6), 4.80 (d,J= 3.8 Hz, 1H,H-8), 4.72 (d,J= 6.9 Hz, 1H,H-7), 4.56 (d,J= 4.4 Hz, 1H,H-9), 4.48 (dd,J= 5.7, 2.1 Hz, 2H,H-13), 4.28-4.14 (m, 1H,H-1), 3.85 (dq,J= 8.6, 4.4 Hz, 1H,H-3), 3.53 (dt,J= 6.6, 4.2 Hz, 1H,H-2), 2.53 (dq,J= 4.9, 2.1 Hz, 1H, H-4), 2.05 (ddt,J= 17.8, 4.7, 1.6 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：171.63 (C-10), 167.20 (C-16), 160.86 (C-14), 134.81 (C-6), 133.50 (C-5), 130.83 (C-22), 129.16 (C-21,23), 128.36 (C-20,24), 127.43 (C-19), 99.93 (C-15), 70.67(C-1), 66.74 (C-2), 65.51 (C-3), 34.97(C-13), 30.26 (C-4)。HR-ESI-MS: C17H17ClN2O5 [M+H]+,理论为值365.090 9,实测值为365.090 9。

化合物7：N-((3-(4-溴苯基)异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(330.5 mg, 产率81%), 熔点: 161～163 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.58 (t,J= 5.8 Hz, 1H,H-11), 7.81 (d,J= 8.5 Hz, 2H,H-20,24), 7.69 (d,J= 8.6 Hz, 2H,H-21,23), 6.85 (s, 1H,H-15), 6.45～6.34 (m, 1H,H-6), 4.84 (d,J= 3.8 Hz, 1H.H-8), 4.75 (d,J= 6.9 Hz, 1H,H-7), 4.58 (d,J= 4.4 Hz, 1H,H-9), 4.48 (dd,J= 5.8, 2.2 Hz, 2H,H-13), 4.21 (dd,J= 4.8, 2.5 Hz, 1H,H-1), 3.85 (dt,J= 8.4, 4.3 Hz, 1H,H-3), 3.53 (dt,J= 7.1, 4.0 Hz, 1H,H-2), 2.55～2.51 (m, 1H,H-4), 2.09～2.00 (m, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：171.72 (C-10), 167.36 (C-16), 161.06 (C-14), 133.61 (C-6), 132.19 (C-21,23), 130.93 (C-5), 128.68 (C-20,24), 127.85(C-19), 123.67(C-22), 100.01 (C-15), 70.76 (C-1), 66.84 (C-2), 65.62 (C-3), 35.07 (C-13), 30.35 (C-4)。HR-ESI-MS: C17H17BrN2O5[M+H]+,理论为值409.039 3,实测值为409.039 3。

化合物8：N-((3-(3,4-二氟苯基)异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(194.0 mg, 产率53%), 熔点: 168～170 °C;1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ：7.77 (ddd,J= 11.4, 7.7, 2.1 Hz, 1H,H-20), 7.66 (ddt,J= 8.0, 3.8, 1.7 Hz, 1H,H-24), 7.39 (dt,J= 10.4, 8.4 Hz, 1H,H-21), 6.72 (s, 1H,H-15), 6.52 (dd,J= 3.8, 1.8 Hz, 1H,H-6), 4.61 (d,J= 1.2 Hz, 2H,H-13), 4.42～4.36 (m, 1H,H-1), 4.03 (dt,J= 7.6, 5.4 Hz, 1H,H-3), 3.69 (dd,J= 7.5, 4.2 Hz, 1H,H-2), 2.78 (ddt,J= 17.7, 5.0, 1.8 Hz, 1H,H-4), 2.22 (ddt,J= 17.8, 5.8, 1.7 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：171.85 (C-10), 167.23 (C-16), 160.25 (C-14), 151.50 (d,J= 12.4 Hz), 150.75 (d,J= 12.9 Hz)(C-23), 149.52 (d,J= 12.5 Hz), 148.79 (d,J= 12.8 Hz)(C-22), 133.54 (C-6), 130.85 (C-5), 126.16 (d,J= 3.1 Hz,C-19), 123.81 (dd,J= 7.0, 3.6 Hz,C-20), 118.42 (d,J= 17.6 Hz,C-24), 115.96 (d,J= 18.6 Hz,C-21), 100.07 (C-15), 70.71 (C-1), 66.75 (C-2), 65.54 (C-3), 35.00 (C-13), 30.29 (C-4)。19F NMR (471 MHz, DMSO-d6),δ：-136.21 (d,J= 22.5 Hz), -137.49 (d,J= 22.1 Hz).HR-ESI-MS: C17H16FN2O5[M+H]+,理论值为367.110 0,实测值为367.110 0。

化合物9：3,4,5-三羟基-N-((3-(4-(三氟甲基)苯基)异噁唑-5-基)甲基)环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(290.6 mg, 产率73%), 熔点: 153～155 °C;1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ：8.03 (d,J= 8.0 Hz, 2H,H-21,23), 7.80 (d,J= 8.0 Hz, 2H,H-20,24), 6.80 (s, 1H,H-15), 6.54 (d,J= 3.7 Hz, 1H,H-6), 4.63 (s, 2H,H-13), 4.40 (d,J= 4.0 Hz, 1H,H-1), 4.03 (q,J= 6.0 Hz, 1H,H-3), 3.70 (dd,J= 7.6, 4.2 Hz, 1H,H-2), 2.79 (dd,J= 17.9, 4.9 Hz, 1H,H-4), 2.24 (s, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：172.02 (C-10), 167.26 (C-16), 160.79 (C-14), 133.57 (C-6), 132.50 (C-5), 130.84 (C-19), 130.18 (d,J= 32.2 Hz,C-22), 127.42 (C-20,24), 126.02 (d,J= 3.8 Hz,C-21,23), 123.99 (d,J= 271.7 Hz,C-25), 100.21(C-15), 70.71 (C-1), 66.76 (C-2), 65.55 (C-3), 35.02 (C-13), 30.30 (C-4)。19F NMR (471 MHz, DMSO-d6),δ：-61.34。HR-ESI-MS: C18H17F3N2O5[M+H]+,理论值为399.116 2,实测值为399.116 2。

化合物10：N-((3-(3-氯-4-甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(201.7 mg, 产率56% ), 熔点: 132～134 °C;1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ：7.85～7.75 (m, 1H, H-20), 7.73 (dt,J= 7.5, 3.8 Hz, 1H,H-24), 7.20～7.03 (m, 1H,H-23), 6.67 (s, 1H,H-15), 6.53 (d,J= 2.1 Hz, 1H,H-6), 4.60 (s, 2H,H-13), 4.46-4.33 (m, 1H,H-1), 4.03 (dd,J= 9.0, 4.0 Hz, 1H,H-3), 3.95 (s, 1H,H-2), 3.70 (dd,J= 7.6, 4.2 Hz, 3H,H-26), 2.78 (dd,J= 18.0, 5.4 Hz, 1H,H-4), 2.31-2.14 (m, 1H, H-4).13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ：172.04 (C-10), 170.29 (C-16), 162.60 (C-14), 157.95 (C-22), 133.95 (C-6), 133.40 (C-5), 129.29 (C-20), 127.77 (C-24), 123.77 (d,J= 83.9 Hz,C-19), 115.43 (C-21), 113.65 (C-23), 100.90 (C-15), 72.84 (C-1), 68.35 (C-2), 67.35 (C-3), 56.78 (C-26), 36.33 (C-13), 31.79 (C-4)。HR-ESI-MS: C18H19ClN2O6[M+H]+,理论值为395.090 4, 实测值为395.090 4。

化合物11：N-((3-(2,6-二氯-3,4,5-三甲氧基苯基)异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-羧酰胺, 白色固体(189.11 mg, 产率45%), 熔点: 116～118 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.46 (t,J= 6.0 Hz, 1H,H-11), 6.29 (s, 1H,H-15), 6.25 (d,J= 2.8 Hz, 1H,H-6), 4.75-4.68 (m, 1H,H-8), 4.63 (d,J= 6.8 Hz, 1H,H-7), 4.48～4.43 (m, 1H,H-9), 4.40 (t,J= 5.6 Hz, 2H,H-13), 4.07(s, 1H,H-1), 3.80 (s, 3H,H-30), 3.73 (s, 1H,H-3), 3.71 (s, 6H,H-26,28), 3.40 (d,J= 5.2 Hz, 1H,H-2), 2.48-2.28 (m, 1H,H-4), 1.91 (dd,J= 17.9, 4.5 Hz, 1H,H-4).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：171.22 (C-10), 167.49 (C-16), 158.52 (C-14), 149.18 (C-21,23), 148.88 (C-22), 133.68 (C-6), 131.02 (C-5), 123.67 (C-19), 123.48 (C-20,24), 103.36 (C-15), 70.79 (C-1), 66.91 (C-2), 65.68 (C-3), 61.53 (C-26), 61.26 (C-28,30), 35.08 (C-13), 30.42 (C-4)。HR-ESI-MS: C20H22Cl2N2O8[M+H]+,理论值为489.082 5,实测值为489.082 5。

1.1 一般资料 选择2015年6月～2017年5月在我院骨科就诊的股骨中下段术后患者48例。纳入标准：临床诊断股骨中下段骨折，行切开复位髓内钉/单钢板内固定术；年龄18～55岁。排除标准：伴有膝关节内骨折、韧带损伤、周围神经损伤，或合并全身多发性骨折等，合并严重心、脑、肺、肝、肾疾病；既往患有膝关节骨关节病史等陈旧性损伤患者；骨肿瘤或肿瘤转移等原因导致的病理性骨折患者。所有患者均签署《康复知情同意书》，48例患者采用随机区组法分为观察组和对照组各24例。2组患者一般资料比较差异无统计学意义，具有可比性。见表1。

化合物12：3,4,5-三羟基-N-((3-苯基-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(186.0 mg, 产率56 % ), 熔点: 141～143 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.05 (td,J= 5.9, 3.9 Hz, 1H,H-11), 7.66～7.59 (m, 2H.H-20,24), 7.43～7.40 (m,3H,H-21,22,23), 6.44～6.19 (m, 1H,H-6), 4.81～4.72 (m, 2H,H-7,8), 4.66 (dd,J= 6.9, 2.7 Hz, 1H,H-9), 4.51 (d,J= 4.3 Hz, 1H,H-14), 4.15 (m, 1H,H-1), 3.80 (dq,J= 8.5, 4.5 Hz, 1H,H-3), 3.48 (dt,J= 7.2, 4.1 Hz, 1H,H-2), 3.42 (dd,J= 17.0, 10.5 Hz, 1H,H-13), 3.32～3.25 (m, 1H,H-13), 3.25～3.19 (m, 1H,H-15), 3.19～3.14 (m, 1H,H-15), 2.46 (ddq,J= 12.0, 6.8, 2.3 Hz, 1H,H-4), 1.98 (ddd,J= 17.6, 5.6, 3.2 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：167.54 (C-10), 156.51 (C-16), 132.85 (C-6), 131.26 (C-5), 130.08 (C-19), 129.41 (C-22), 128.83 (C-21,23), 126.58 (C-20,24), 79.02 (C-14), 70.81 (C-1), 66.76 (C-2), 65.57 (C-3), 42.20 (C-13), 37.57 (C-15), 30.46 (C-4)。HR-ESI-MS: C17H20N2O5[M+H]+,理论值为333.144 4,实测值为333.144 4。

化合物13：4,5-三羟基-N-((3-(对甲苯基)-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(186.0 mg, 产率56 %), 熔点: 116～118 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.06 (q,J= 5.2 Hz, 1H,H-11), 7.53 (d,J= 8.0 Hz, 2H,H-20,24), 7.24 (d,J= 8.0 Hz, 2H,H-21,23), 6.31 (d,J= 3.0 Hz, 1H,H-6), 4.72～4.79 (m, 2H,H-7,8), 4.67 (dd,J= 7.0, 2.4 Hz, 1H,H-9), 4.52 (d,J= 4.4 Hz, 1H,H-14), 4.20-4.12 (m, 1H,H-1), 3.81 (dq,J= 8.6, 4.6 Hz, 1H,H-3), 3.49 (dt,J= 7.3, 4.3 Hz, 1H,H-2), 3.41 (dd,J= 17.0, 10.5 Hz, 1H,H-13), 3.31～3.25 (m, 1H,H-13), 3.25～3.19 (m, 1H,H-15), 3.18-3.13 (m, 1H,H-15), 2.45 (dd,J= 4.8, 2.4 Hz, 1H,H-4), 2.32 (s, 3H,H-25), 1.99 (dt,J= 17.8, 4.3 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：167.50 (C-10), 156.33 (C-16), 139.80 (C-22), 132.82 (C-6), 131.24 (C-5), 129.37 (C-21,23), 126.63 (C-19), 126.52 (C-20,24), 78.80 (C-14), 70.79 (C-1), 66.75 (C-2), 65.55 (C-3), 42.20 (C-13), 37.67 (C-15), 30.44 (C-4), 20.99 (C-25)。HR-ESI-MS: C18H22N2O5[M+H]+,理论值为347.160 1,实测值为347.160 1。

化合物14：3,4,5-三羟基-N-((3-(4-异丙基苯基)-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)环己-1-烯-1-甲酰胺, 黄色油状液体(291.8 mg, 产率78 %);1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ：7.60 (d,J= 8.1 Hz, 2H,H-20,24), 7.30 (d,J= 8.0 Hz, 2H,H-21,23), 6.43 (dd,J= 3.9, 1.9 Hz, 1H,H-6), 4.38～4.29 (m, 1H,H-14), 3.99 (q,J= 6.0 Hz, 1H,H-1), 3.64 (dt,J= 8.4, 4.6 Hz, 1H,H-3), 3.54～3.42 (m, 3H,H-2,13), 3.37(s,1H.H-15), 3.22 (dd,J= 17.1, 7.0 Hz, 1H,H-15), 2.94 (p,J= 6.9 Hz, 1H,H-25), 2.74 (dt,J= 18.0, 5.8 Hz, 1H,H-4), 2.18 (dd,J= 17.8, 6.2 Hz, 1H,H-4), 1.27 (d,J= 6.9 Hz, 6H,H-26,27)。13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ：170.81 (C-10), 158.53 (C-16), 152.72 (C-22), 133.94 (C-6), 133.11 (C-5), 128.14 (C-19), 127.91 (C-20,24), 127.87 (C-21,23), 80.64 (C-14), 73.02 (C-1), 68.20 (C-2), 67.32 (C-3), 43.76 (C-13), 38.89 (C-15), 35.28 (C-25), 32.13 (C-4), 24.17 (C-26,27)。HR-ESI-MS: C20H26N2O5[M+H]+,理论值为375.191 4,实测值为375.191 4。

化合物15：N-((3-(4-(叔丁基)苯基)-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(310.6 mg, 产率80 %), 熔点: 119～121 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.08～8.01 (m, 1H,H-11), 7.56 (d,J= 8.4 Hz, 2H,H-20,24), 7.45 (d,J= 8.4 Hz, 2H,H-21,23), 6.31 (s, 1H,H-6), 4.79～4.71 (m, 2H,H-7,8), 4.67 (dd,J= 6.9, 2.6 Hz, 1H,H-9), 4.52 (d,J= 4.4 Hz, 1H,H-14), 4.17 (s, 1H,H-1), 3.81 (dq,J= 8.6, 4.6 Hz, 1H,H-3), 3.49 (dt,J= 7.3, 4.1 Hz, 1H,H-2), 3.41 (dd,J= 17.0, 10.5 Hz, 1H,H-13), 3.32-3.26 (m, 1H,H-13), 3.25～3.19 (m, 1H,H-15), 3.16 (dd,J= 17.0, 6.5 Hz, 1H,H-15), 2.47-2.44 (m, 1H,H-4), 2.03～1.93 (m, 1H,H-4), 1.27 (s, 9H,H-26,27,28)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：167.50 (C-10), 156.28 (C-16), 152.80 (C-25), 132.83 (C-6), 131.24 (C-5), 126.65 (C-19), 126.40 (C-20,24), 125.58 (C-21,23), 78.82 (C-14), 70.79 (C-1), 66.75 (C-2), 65.55 (C-3), 42.17 (C-13), 37.68 (C-15), 34.57 (C-25), 30.93 (C-26,27,28), 30.44 (C-4)。HR-ESI-MS: C21H28N2O5[M+H]+,理论值为389.207 0,实测值为389.207 0。

化合物16：N-((3-(4-氟苯基)-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 黄色油状液体(252.1 mg, 产率72 %);1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.07-8.01 (m, 1H,H-11), 7.68 (dd,J= 8.7, 5.6 Hz, 2H,H-20,24), 7.26 (t,J= 8.9 Hz, 2H,H-21,23), 6.30～6.28 (m, 1H,H-6), 4.80～4.74 (m, 2H,H-7,8), 4.66 (dd,J= 6.9, 2.7 Hz, 1H,H-9), 4.51 (d,J= 3.3 Hz, 1H,H-14), 4.15 (s, 1H,H-1), 3.79 (dq,J= 8.7, 4.6 Hz, 1H,H-3), 3.48 (dt,J= 6.7, 4.2 Hz, 1H,H-2), 3.42 (dd,J= 17.1, 10.6 Hz, 1H,H-13), 3.31～3.25 (m, 1H,H-13), 3.25～3.19 (m, 1H,H-15), 3.19～3.13 (m, 1H,H-15), 2.45-2.42 (m, 1H,H-4), 1.97(d,J= 17.5 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：167.55 (d,J= 2.5 Hz,C-10), 163.02 (d,J= 248.0 Hz,C-22), 155.69 (C-16), 132.86 (C-6), 131.25 (C-5), 128.90 (d,J= 8.6 Hz,C-20,24), 126.03 (d,J= 3.2 Hz,C-19), 115.90 (d,J= 21.8 Hz,C-21,23), 79.17 (C-14), 70.79 (C-1), 66.76 (C-2), 65.56 (C-3), 42.17 (d,J= 3.2 Hz,C-13), 37.66 (C-15), 30.44 (C-4)。19F NMR (471 MHz, DMSO-d6),δ：-109.37 (d,J= 2.3 Hz).HR-ESI-MS: C17H19FN2O5[M+H]+,理论值为351.135 0,实测值为351.135 0。

化合物17：N-((3-(4-氯苯基)-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(281.9 mg, 产率77%), 熔点: 122～124 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.03 (td,J= 5.9, 3.9 Hz, 1H,H-11), 7.60 (d,J= 8.6 Hz, 2H,H-20,24), 7.45 (d,J= 8.7 Hz, 2H,H-21,23), 6.31～6.22 (m, 1H,H-6), 4.74 (dtd,J= 10.6, 6.2, 1.9 Hz, 2H,H-7,8), 4.67 (s, 1H,H-9), 4.52 (s, 1H,H-14), 4.12 (s, 1H,H-1), 3.77 (q,J= 5.0 Hz, 1H,H-3), 3.45 (dd,J= 6.7, 4.1 Hz, 1H, H-2), 3.42～3.36 (m, 1H, H-13), 3.29～3.10(m, 3H,H-13,15), 2.44～2.35(m, 1H,H-4), 2.00～1.89 (m, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ：170.89 (C-10), 157.64 (C-16), 137.13 (C-6), 133.92 (C-5), 133.15 (C-22), 130.04 (C-21,23), 129.47 (C-19), 129.28 (C-20,24), 81.16 (C-14), 72.99 (C-1), 68.22 (C-2), 67.32 (C-3), 43.72 (C-13), 38.57 (C-15), 32.09 (C-4)。HR-ESI-MS: C17H19ClN2O5[M+H]+,理论值为367.105 5,实测值为367.105 5。

化合物18：N-((3-(4-溴苯基)-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(284.3 mg, 产率69% ), 熔点: 133～135 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.06 (q,J= 5.6 Hz, 1H,H-11), 7.63 (d,J= 8.6 Hz, 2H,H-20,24), 7.57 (d,J= 8.6 Hz, 2H,H-21,23), 6.30 (t,J= 2.2 Hz, 1H,H-6), 4.84～4.73 (m, 2H,H-7,8), 4.67 (dd,J= 6.9, 2.5 Hz, 1H,H-9), 4.51 (dd,J= 4.4, 1.6 Hz, 1H,H-14), 4.18～4.14 (m, 1H,H-1), 3.80 (dq,J= 8.7, 4.6 Hz, 1H,H-3), 3.48 (dt,J= 6.5, 4.2 Hz, 1H,H-2), 3.43 (dd,J= 17.1, 10.6 Hz, 1H,H-13), 3.29-3.23 (m, 1H,H-13), 3.22～3.16 (m, 1H,H-15), 3.13 (ddd,J= 17.1, 6.6, 1.3 Hz, 1H,H-15), 2.45 (dt,J= 4.7, 2.2 Hz, 1H,H-4), 2.01-1.95 (m, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：167.54 (C-10), 155.88 (C-16), 132.86 (C-6), 131.83 (C-21,23), 131.23 (C-5), 128.64 (C-19), 128.52 (C-20,24), 123.37 (C-22), 79.39 (C-14), 70.78 (C-1), 66.75 (C-2), 65.55 (C-3), 42.16 (C-13), 37.35 (C-15), 30.43 (C-14)。HR-ESI-MS: C17H19BrN2O5[M+H]+,理论值为413.052 2,实测值为413.052 2。

化合物19：N-((3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(177.9 mg, 产率49% ), 熔点: 146～148 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.03 (q,J= 5.5 Hz, 1H,H-11), 7.63 (d,J= 2.1 Hz, 1H,H-20), 7.55 (dd,J= 8.6, 2.1 Hz, 1H,H-24), 7.18 (d,J= 8.7 Hz, 1H,H-23), 6.29 (d,J= 3.0 Hz, 1H,H-6), 4.78-4.71 (m, 2H,H-7,8), 4.67 (s, 1H,H-9), 4.53 (s, 1H,H-14), 4.14 (s, 1H,H-1), 3.86 (s, 3H,H-26), 3.79 (q,J= 5.2 Hz, 1H,H-3), 3.47 (dd,J= 6.6, 4.1 Hz, 1H,H-2), 3.42～3.36 (m, 1H, H-13), 3.30～3.24 (m, 1H,H-13), 3.23-3.17 (m, 1H,H-15), 3.16～3.11 (m, 1H,H-15), 2.46～2.40 (m, 1H,H-4), 1.96 (ddq,J= 17.7, 4.7, 2.4, 1.7 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：167.54 (d,J= 2.8 Hz,C-10), 155.75 (C-22), 155.31 (C-16), 132.87 (C-6), 131.26 (C-5), 127.76 (C-20), 126.92 (C-19), 122.80 (C-24), 121.45 (C-21), 112.99 (C-23), 79.06(C-14), 70.82(C-1), 66.76 (C-2), 65.58(C-3), 56.38(C-27), 42.18 (d,J= 2.6 Hz,C-13), 37.60 (C-15), 30.47 (C-4)。HR-ESI-MS: C18H21ClN2O6[M+H]+,理论值为397.116 0,实测值为397.116 0。

化合物20：N-((3-(2-氯-3,4,5-三甲氧基苯基)-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(168.9 mg, 产率40%), 熔点: 83～85 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.04 (d,J= 5.1 Hz, 1H,H-11), 7.38 (d,J= 1.5 Hz, 1H,H-20), 6.30 (d,J= 2.3 Hz, 1H,H-6), 4.75 (d,J= 3.8 Hz, 2H,H-7,8), 4.66 (dd,J= 6.9, 3.6 Hz, 1H,H-9), 4.50 (d,J= 4.4 Hz, 1H,H-14), 4.21～4.11 (m, 1H,H-1), 3.84 (d,J= 3.3 Hz, 6H,H-28,30), 3.82～3.79 (m, 1H,H-3), 3.78 (s, 3H,H-26), 3.48 (td,J= 7.2, 6.3, 3.1 Hz, 1H,H-2), 3.41 (dd,J= 17.5, 10.5 Hz, 1H,H-13), 3.31～3.25 (m, 1H,H-13), 3.24～3.20 (m, 1H,H-15), 3.19～3.15 (m, 1H,H-15), 2.47～2.43 (m, 1H,H-4), 1.97 (ddd,J= 17.5, 4.8, 2.3 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：167.56 (C-10), 153.98 (C-16), 151.30 (C-23), 150.88 (C-21), 147.79 (C-22), 132.83 (C-6), 131.28 (C-5), 123.02 (C-19), 122.04 (C-24), 120.20 (C-20), 79.11 (C-14), 70.81 (C-1), 66.75 (C-2), 65.57 (C-3), 61.38 (C-13), 61.08 (C-26,28,30), 42.09 (C-15), 30.46 (C-4)。HR-ESI-MS: C20H25ClN2O8[M+H]+,理论值为457.137 2,实测值为457.137 2。

化合物22：N-((3-(3,5-二氯-4-(二甲氨基)苯基)-4,5-二氢异噁唑-5-基)甲基)-3,4,5-三羟基环己-1-烯-1-甲酰胺, 白色固体(142.6 mg, 产率38% ), 熔点: 111～113 °C;1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ：8.00 (q,J= 5.9 Hz, 1H,H-11), 7.62～7.49 (m, 2H,H-20,24), 6.35～6.16 (m, 1H,H-6), 4.79～4.70 (m, 2H,H-7,8), 4.63 (d,J= 14.5 Hz, 1H,H-9), 4.49 (s, 1H,H-14), 4.12 (s, 1H,H-1), 3.76 (q,J= 5.5 Hz, 1H,H-3), 3.51～3.41 (m, 1H,H-2), 3.28-3.07 (m, 4H,H-13,15), 2.77 (s, 6H,H-26,27), 2.48～2.38 (m, 1H,H-4), 1.94 (dt,J= 18.0, 5.1 Hz, 1H,H-4)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ：167.60 (d,J= 3.6 Hz,C-10), 154.75 (C-16), 146.89 (C-22), 134.24 (C-20,24), 132.90 (C-6), 131.30 (C-5), 127.48 (C-19), 127.13 (C-21,23), 79.73 (C-14), 70.87 (C-1), 66.78 (C-2), 65.61 (C-3), 42.17 (C-13), 42.09 (C-26,27), 37.23 (C-15), 30.51 (C-4)。HR-ESI-MS: C19H23Cl2N3O5[M+H]+,理论值为444.108 7,实测值为444.108 7。

1.3 体外抗 HBV 活性实验

1.4 分子对接

分子结构优化软件使用 HyperChem8.0.7版本。对接计算软件使用MOE 2015.10版本[19]。以乙肝病毒的核心蛋白片段(PDB ID 3KXS)为靶标对活性化合物进行模拟对接。在MOE中对3KXS蛋白进行除水、3D质子化、加电荷、能量最小化等操作,然后寻找配体最佳活性位点,将优化好的化合物与靶标蛋白进行对接,选取结合能最低的构象,以化合物与靶标蛋白对接的结合自由能、化合物与蛋白氨基酸残基所形成的氢键等为依据进行具体分析,模拟4个活性化合物的抗 HBV活性。

2 结果与讨论

2.1 目标化合物合成

莽草酸与过量乙酸酐进行酯化反应得到三乙酰氧基莽草酸化合物Ⅰ1。Ⅰ1与烯丙胺盐酸盐反应形成的酰胺,1H NMR与三乙酰氧基莽草酸Ⅰ1相比,在δ(8.24)处出现了HN峰,δ(3.80～3.57)处出现的新峰是酰烯丙胺上的亚甲基H,δ(5.74)处出现的新峰是酰烯丙胺上与亚甲基相连的烯的H。δ(5.03～4.97)处出现的新峰是酰烯丙胺上末端烯的H。Ⅰ3与过量氨水进行水解反应得到莽草酰烯丙胺化合物Ⅰ5。

莽草酰炔丙胺Ⅰ4与各种肟Ⅰ6生成的氧化氰关环得到异噁唑化合物。以化合物5为例,在MS谱图中出现了[M+1]+峰:349.119 4;19F NMR显示出现一个-109.37 的F信号。1H NMR与莽草酰炔丙胺相比,莽草酸部分信号基本不变,炔丙胺基中末端炔H的8(2.64)峰消失,δ(5.87)处出现的新峰是对氟苯甲醛肟与莽草酰胺中的炔发生关环反应形成的新的烯烃的H。出现的新引进的苯环信号,δ(7.04)多重峰为F间位的2个H信号,δ(6.40)多重峰是F邻位的2个H信号[20]。13C NMR显示,除了莽草酸部分信号171.79 (C-10)、133.60 (C-6)、133.06 (C-5)、72.50 (C-1)、68.00 (C-2)、67.00 (C-3)、31.46 (C-4)外,增加了炔丙胺基中亚甲基的信号35.99 (C-13),异噁唑基的信号169.95 (C-16)、162.64 (C-14)、100.73 (C-15)和苯环的信号164.95 (d,J= 248.7 Hz,C-22)、129.65 (d,J= 8.4 Hz,C-20,24)、126.29 (d,J= 3.3 Hz,C-19)、116.63 (d,J= 22.2 Hz,C-21,23)。

莽草酸酰烯丙胺Ⅰ5与各种肟Ⅰ6生成的氧化氰反应得到环肟醚(二氢异噁唑)化合物。以化合物16为例,在MS谱图中出现了[M+1]+峰: 351.135 0;19F NMR显示出现一个-110.80的F信号。1H NMR与莽草酰烯丙胺相比,莽草酸部分信号基本不变,酰烯丙胺中烯烃H在δ(5.96, 5.29～5.15)消失,δ(4.51)处出现的新峰是对氟苯甲醛肟与莽草酰胺中的烯发生关环反应形成的新的叔碳上的H,δ(3.25～3.19, 3.19～3.13)是新形成的亚甲基的H。酰烯丙胺中亚甲基的H电子云密度变大,δ由3.89减小到3.42, 3.31～3.25。出现的新引进的苯环信号,δ(7.68)多重峰为F间位的2个H信号,δ(7.26)多重峰是F邻位的2个H信号[21]。13C NMR显示,除了莽草酸部分信号167.55 (d,J=2.5 Hz,C-10)、132.86 (C-6)、131.25 (C-5)、70.79 (C-1)、66.76 (C-2)、65.56 (C-3)、30.44 (C-4)外,增加了烯丙胺基中亚甲基的信号42.17 (d,J= 3.2 Hz,C-13)、二氢异噁唑基的信号155.69 (C-16)、79.17 (C-14)、37.66 (C-15)和苯环的信号163.02 (d,J= 248.0 Hz,C-22)、128.90 (d,J= 8.6 Hz,C-20,24)、126.03 (d,J= 3.2 Hz,C-19)、115.90 (d,J= 21.8 Hz,C-21,23)。

2.2 化合物理化性质

口服药物利用率低的主要原因是药物的水溶性差,溶解度低和溶出度低。目前已上市的药物中约40%属于难溶性化合物,新型活性药物水溶性差限制了其进一步的开发[22]。用ChemDraw、ChemSketch软件模拟目标化合物的理化性质,模拟结果见表1。结果显示以莽草酸为母体合成的药物分子,增加了药物的水溶性,很大程度地改善了水溶性差的问题。

表1 化合物的理化性质Tab.1 Physical and chemical properties of compounds

2.3 体外抗 HBV 活性实验

毒性实验结果表明目标化合物的毒性均小于3TC组。活性实验结果表明(表2), 化合物11、14、15、17可抑制HBV的表面抗原或E抗原。其中化合物14、15、17对HepG 2.2.15细胞的HBeAg具有一定的抑制活性。化合物11对HBsAg具有一定的抑制活性。整体来看,苯异噁唑基莽草酰胺化合物都表现出较低的毒性,同时能够抑制HBV病毒HBsAg和HBeAg的分泌。其中活性最好的化合物是化合物17,毒性较低,抑制效果最好,S=1.83。

表2 目标化合物的细胞毒性及对HBeAg、HBsAg的抑制能力Tab.2 Cytotoxicity of target compounds and inhibitory capacity against HBeAg and HBsAg

2.4 分子对接

用MOE 2015.10版,将活性化合物分别与HBV核心蛋白片段(PDB ID 3KXS)进行分子模拟对接,对接结果如表3所示。由活性化合物与3KXS蛋白结合的自由能可以推测这些化合物可能具有潜在的抗HBV活性。化合物11、14、15、17的S值较小,与活性实验抗乙肝效果较好的药物基本一致。实验结果与模拟对接结果相近,推测实际作用靶点和对接靶点可能相同。可以进一步考虑将活性好的化合物与实际的靶标蛋白进行对接,来确定化合物的作用靶点。蛋白对接模拟计算结果可以作为预测新合成化合物活性的重要参考。

表3 活性化合物与 3KXS 对接结果Tab.3 Docking results of active compounds with 3KXS

活性化合物中化合物11的O7原子与氨基酸残基ASP22形成氢键,氢键键长为2.99 nm,S为-28.617 3 kJ/mol,其与蛋白相互作用如图3所示。化合物14的2个羟基上的氧原子O7, O8均与氨基酸残基SER17形成氢键,氢键键长为3.08、2.85 nm,苯环也与MET1有相互作用,S为-27.005 5 kJ/mol。化合物15的O7原子与氨基酸残基ASP32形成氢键,氢键键长为3.02 nm,S为-27.667 1 kJ/mol。化合物17的O7原子与氨基酸残基ASP32形成氢键,氢键键长为3.11 nm,S为-27.461 7 kJ/mol。

(a) 2D

(b) 3D

3 结语

以莽草酸为原料设计合成了22个异噁唑环衍生物,通过1H NMR、13C NMR和 MS 对化合物的结构进行分析。利用CCK-8法测定化合物的细胞毒性,酶联免疫法测定化合物的抗乙肝病毒活性,并利用 MOE 分子对接软件对化合物的抗 HBV 活性进行了模拟证明。结果表明,苯异噁唑基莽草酰胺衍生物的毒性低,化合物11、14、15和17能较好地抑制乙肝病毒HBeAg 和HBsAg的分泌。活性化合物的分子对接结果显示,化合物与核心蛋白片段(PDB ID 3KXS)具有较好的相互作用。该研究为抗 HBV 药物的分子设计提供了新的思路与一定的理论依据。