免疫组化技术鉴别肺活检标本腺癌及鳞癌的研究

吴学忠，毛瑶虹

(1.安徽理工大学第一附属医院,安徽 淮南 232001；2.安徽理工大学医学院,安徽 淮南 232001)

目前，肺癌是全球最常见的癌症之一，具有非常高的发病率及死亡率，其中绝大多数是非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer，NSCLC)[1]。肺癌的治疗原则在于早发现、早诊断、早治疗。近些年来，随着微创技术的发展，CT或B超引导下的经皮肺穿刺活检、经纤维支气管镜肺组织活检等技术的普遍应用使得肺癌的诊断方式变得更加多元化。病理科医师对于疑似肺癌标本的诊断主要通过组织形态学评估，然而组织学判断可能会受到标本量少或肿瘤分化差等因素的限制，无法作出精准分型，因此必须进一步行免疫组化检查。

现有理论成果表明，免疫组化技术在肺癌的诊断方面具有非常重要的作用[2]。对于肺腺癌及鳞癌的鉴别，目前主要的辅助诊断分子标志物包括TTF-1、P40、Napsin A和细胞角蛋白CK5/6等[3]。有专家认为：TTF-1、P40、P63组合能够对肺腺癌及鳞癌作出基本判断，但在实际工作中发现肺鳞癌的某些分子标记物也在腺癌中出现阳性表达，并有报道称P63在腺癌中的阳性表达率为0%～65%[4-5]1 348，从而导致鉴别困难。

为此，本文通过回顾性分析肺活检标本腺癌及鳞癌的免疫组化结果，利用统计学方法试图找出最优分子标记物组合以达到肺组织标本的最大化利用，以期为肺癌的诊断提供一定的方法依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究收集了2016a 11月～2021a 12月在安徽理工大学第一附属医院住院的237例非小细胞肺癌患者的肺小样本和临床病理资料。免疫组化所用组织均为肺小样本，其中腺癌116例、鳞癌121例。腺癌患者中男女比为17/12，年龄在34～84岁，平均年龄65.5岁；主要由纤支镜活检(33例)、经皮肺穿刺活检(52例)、胸腔镜下胸膜活检(2例)及胸腔积液检查(29例)获得标本。鳞癌患者男女比为114/7，年龄在48～83岁，平均年龄68.1岁。主要由纤支镜活检(69例)和经皮肺穿刺活检(52例)获得标本。经纤支镜活检和经皮穿刺活检者后期行肺癌根治手术治疗，获得肿瘤大标本后作形态学诊断；2例胸膜活检患者术中肺部可见多发结节病灶，给予切除，以防止单纯胸膜活检无法作出准确诊断；29例胸腔积液患者需行液基细胞学检查及沉渣包埋切片，为形态学诊断提供依据。

1.2 免疫组化标记物

使用BenchMark GX自动染片机(美国Ventana Medical Systems公司生产)行免疫组化染色。所有标本均经4%中性甲醛固定，常规脱水后石蜡包埋，4μm连续切片后行苏木精-伊红染色法 (Hematoxylin-eosin staining，HE)染色。所用一抗Napsin A、TTF-1、CK7、P63、P40、CK5/6均采用鼠单抗，来源于福州迈新生物技术开发公司。免疫组化染色方法及步骤严格按照试剂盒说明进行,其中≥50%的肿瘤细胞染色被判定为阳性，而局灶阳性为1%～49%的肿瘤细胞染色，肿瘤细胞未染色被判定为阴性。

1.3 数据分析

采用SPSS 23.0统计学软件进行统计学分析,组间比较采用Fisher确切概率法及卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。对于每个标记物，以形态学为诊断标准，通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic，ROC)分析计算灵敏度和特异度，其中曲线下面积(area under the curve，AUC)在0.5(表示没有预测价值)和1(完美预测值)之间。

2 结果

2.1 不同分子标记物的免疫组化表达

P63、P40 标记物在肺腺癌患者中显示出一定的免疫异质性，肺腺癌中分子标记物P63阳性比率为24.2%、P40阳性比率为6.8%。CK5/6在肺腺癌患者中均表达阴性。Napsin A、TTF-1和CK7在诊断肺腺癌中显示出较高的阳性比例(分别为79.5%、94.8%和97.3%)；而所有的肺鳞癌患者显示出高度一致的免疫图谱(Napsin A阴性、P63阳性、P40阳性)，P63、P40和CK5/6在诊断肺鳞癌中显示出较高的阳性比例(分别为100.0%、100.0%和98.8%)。经统计分析发现，Napsin A、TTF-1、CK7、P63、P40和CK5/6在肺腺癌和肺鳞癌中的表达差异具有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 肺腺癌及肺鳞癌两组免疫组化阳性、阴性表达例数及占比

2.2 分子标记物的预测效果

ROC曲线分析结果显示，Napsin A、TTF-1和CK7在诊断肺腺癌中的敏感性为0.795、0.948和0.973， 特异性为1.000、0.983和0.900，AUC为0.896、0.962和0.919。Napsin A的特异性高，但敏感性较低;而CK7具有高度的敏感性，但特异性不高;TTT-1具有良好的敏感性及特异性(见表2)。

表2 Napsin A、TTF-1和CK7诊断肺腺癌的ROC结果

P63、P40和CK5/6在诊断肺鳞癌中的敏感性为0.871，0.957和0.259，特异性为0.793、1.000和0.992，AUC为0.874、0.978和0.625。P40的敏感性及特异性要高于P63，而CK5/6虽然有很好的特异性，但敏感性太低(见表3)。

表3 P63、P40和CK5/6诊断肺鳞癌的ROC结果

2.3 免疫组化分子标记物组合验证

AUC的比值越接近1，代表预测结果越准确。根据以上研究可知，鉴别肺腺癌最有预测价值指标为TTF-1，而鳞癌中以P40最有预测价值(免疫组化染色结果见图1)。P40和TTF-1两种分子标记物联合检测几乎可准确鉴别鳞癌，P40表达阳性，无论TTF-1表达状态如何，即可确定肺鳞癌的分型。在肺鳞癌中，P40表达阳性，TTF-1表达状态为阴性的概率为98.3%，而局灶阳性的概率为1.7%，TTF-1无阳性表达(≥50%的肿瘤细胞染色)；而对于肺腺癌，仍有2.6%的可能性TTF-1表达阴性，P40表达阴性。回顾原始数据可知，2例患者CK7均为阳性表达，因此腺癌的鉴别仍需联合其他分子标记物(见表4)。在鉴别肺腺癌过程中加入CK7分子标记物的阳性率为89.0%，而加入Napsin A分子标记物的阳性率为71.2%。因此，加入CK7的表达准确率比Napsin A高，差异性具有统计学意义，P<0.05(见表5)。在肺腺癌中同时检测TTF-1、P40、CK7及Napsin A，结果发现，CK7的表达均为阳性，而Napsin A的表达为阳性、局灶阳性及阴性的比例分别为54.7%、18.8%及24.6%，从而再次论证了TTF-1/P40/CK7组合的优越性(见表6)。

表4 两种分子标记物组合在肺鳞癌及腺癌中的表达分析

(a)P40在肺鳞癌细胞核中阳性表达(sp×100) (b)TTF-1在肺腺癌细胞核中阳性表达(sp×100)

表5 不同分子标记物组合预测肺腺癌的准确性比较(χ2检验)

表6 4种分子标记物组合在肺腺癌中的表达例数比较

3 讨论

大多数情况下，肺腺癌和鳞状细胞癌很容易通过形态学鉴别，如角化和细胞间桥代表鳞状细胞癌，而通过腺体结构的标志(腺泡、乳头、微乳头或细胞质粘蛋白)即可鉴别腺癌[6]。然而，在一些分化较差的人群中可能难以区分肿瘤类型，给临床诊断带来难度。上述问题在活检样本中比较常见，由于活检样本中缺乏大量肿瘤细胞、挤压伪影或细胞分散，难以显示差异化，这就导致临床工作中有 20～40%的非小细胞肺癌无法分型。免疫组化技术是一种非常有效鉴别肺腺癌和鳞癌的辅助工具，但是其中最优分子标记物诊断组合尚未确定，亟需进一步探索。CK5/6联合TTF-1组合可以区别肺腺癌及鳞癌。文献[7]研究指出p63、TTF1、CK5/6、CK7、Napsin A和mucicarmine是区分肺鳞癌和腺癌的最佳组合；而对于肺标本量有限的患者，建议行p63、TTF1、CK5/6、CK7检测。文献[4]1 357认为TTF-1/p63的双标记组就足以判断肺腺癌及鳞状细胞癌，仅极小部分病例需要增加CK5/6检测，准确率可达100%。文献[8]认为CK5/6联合TTF-1是鉴别肺腺癌及鳞癌最好的免疫组化组合。近年来有学者在少量的肺活检标本上同时进行多重免疫组化染色，利用颜色差异行免疫组化检查，从而确诊肺癌分型，以求彻底解决活检过程中取材量较少致使诊断困难的问题[9-10]。最近一项大型回顾性研究利用贝叶斯理论评估细胞学样本中不同抗体对肺癌分型准确性的影响,作者认为结合形态学和临床资料，使用两种抗体足以检测不同类型的肺癌[11]。

我国肺癌病人较多，大部分患者仍首诊于基层医院，由于基层医院对肺癌检查手段单一，再加上临床医师取材不规范(取材组织较少或术中过度使用电凝致使组织碳化严重)，胸水送检不及时，导致细胞裂解较多[12]。以上种种因素均会导致肺癌诊断出现难以鉴别的情况，限制后期患者的诊疗，加大患者就医成本。为更好地服务基层医院肺癌患者，改善基层医院就医环境，亟需寻求一种合适的肺癌诊断免疫组化体系。本研究发现恶性胸腔积液中腺癌的阳性率远大于鳞癌的阳性率，因此建议对于无法依靠形态学鉴别的恶性胸腔积液患者，行胸水沉渣后免疫组化首选TTF-1及CK7检测；对于通过肺穿刺或纤支镜活检患者出现无法行形态学鉴别的小样本非小细胞肺癌，建议采用P40+TTF-1+CK7分子组合的免疫学检测。上述病理组化体系能够有效地对肺鳞癌和腺癌进行鉴别诊断，具有十分重要的临床意义。

无论是在对传统分子标记物的深度研究还是在寻找新的分子标记物方面，免疫组化技术对于鉴别非小细胞肺癌的分型都比较准确。有研究发现，TTF-1的表达随克隆号不同而显示差异,TTF-1 8G7G3/1可能更适合作为区分腺癌和鳞状细胞癌的主要抗体[13]。且越来越多的分子标记物出现，如三叶肽因子3(Trefoil Factor 3)在腺癌中明显表达，被证实可以区分肺腺癌与鳞癌[14]；血小板亲和蛋白1(PKP1)、角蛋白15(KRT15)和桥粒芯糖蛋白3(DSG3)对肺鳞癌具有高度特异性，当它们与传统标记物结合使用时，能更好地区分肺鳞癌及腺癌[15]。技术革新方面，有专家提出RNAscope(一种新型的RNA 原位杂交技术)在检测TTF-1和Napsin A在原发性肺腺癌中的表达优于免疫组化技术，但仍有极小部分鳞状细胞癌也会被标记为TTF-1阳性[16]。目前也有学者在研究利用人工智能技术辅助肺癌的病理学诊断[17]。本文的不足之处在于样本量较小，且使用的分子标记物较为传统，临床工作中仍会有无法鉴别的非小细胞癌肺癌出现，因此有待更进一步的研究。但就目前而言，本结论对于基层医院病理科仍具有非常重要的意义。