CNFs/SA复合水凝胶球对IBU释放性能的影响

林秀玲，施佳利，章洁琦，潘育松

(安徽理工大学材料科学与工程学院，安徽 淮南 232001)

发烧和疼痛是疾病中常见的症状，治疗发烧的有效药物IBU直接服用对胃粘膜有一定的损害，容易引起恶心、呕吐、食欲不振等症状[1]。另外，它的疏水性也限制了药物的生物利用度，为此选择合适的载体促进IBU在内部环境中实现缓释，并产生持久的镇痛效果是科研工作者追求的目标。

天然高分子材料已广泛应用于各类药物的包裹与递送，可以提高药物的生物利用度降低毒副作用。具有三维网状结构的水凝胶[2]，因其生物相容性好，具有水溶胀性等优点，使得包埋在水凝胶中的药物分子活性能够保持较长时间，增强药物在病灶部位的停留时间和组织渗透性。海藻酸钠(Sodium alginate，SA)是一种天然多糖，主要来源于某些细菌或褐藻。海藻酸钠优异的凝胶形成能力和pH敏感性使SA成为一种被广泛研究的口服药物给药载体[3]。然而单一的海藻酸钠凝胶孔径大，对疏水性药物负载量低[4]，限制了其在药物释放领域的广泛应用。为了克服这个问题，采用混合的方法制备海藻酸钠基复合水凝胶，复合水凝胶作为疏水药物IBU载体，控制IBU释放[5-7]。各种复合组分中，纤维素是植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富的天然聚合物[8]，来源于陆生植物、藻类和真菌等可再生资源。根据不同的原料和加工方法，纤维素主要包括纤维素纳米晶(Cellulose nanocrystals，CNCs)、纤维素纳米纤维(Cellulose nanofibers，CNFs)、细菌纤维素(Bacterial nanoellulose，BNC)和其他纳米/微米尺度的纤维素[9]。其中，CNFs是一种直径为5～50nm、长度为数微米[10]相互缠绕形成网络结构的纤维，可以在水溶液中形成凝胶[11-12]，具有良好的柔韧性、生物相容性和生物降解性，有利于生物材料的发展，被广泛应用于生物医药领域[13]。

文章采用CNFs复合SA制成的水凝胶球作为疏水性IBU的载体，SA在氯化钙(CaCl2)溶液中形成凝胶的条件温和，可以避免药物失去活性。对CNFs/SA复合水凝胶球的形貌进行表征，并探讨CNFs对水凝胶的成型性和溶胀性的影响，进而研究复合水凝胶球中CNFs含量对IBU释放性能的影响。CNFs/SA复合水凝胶药物载体有望改善胃部酸性环境对口服给药的影响，达到对药物缓释的作用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：海藻酸钠购于福晨(天津)化学试剂有限公司，化学纯，粘度范围为1.05～1.15Pa·s；纤维素纳米纤维购于北方世纪(江苏)纤维素材料有限公司，纯度99.9%，结晶度≥75%；IBU购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度≥98%；氯化钙购于无锡市展望化工试剂有限公司，纯度≥96%；氢氧化钠(NaOH)购于上海沃凯生物科技有限公司，纯度≥96%；生理盐水购于安徽双鹤药业有限公司。

仪器：电子天平(YP-B2003，上海光正医疗仪器有限公司)；42步进电机微型蠕动泵(LHZWOO5，惠州市联合众为科技有限公司)；数显高温磁力搅拌器(90-2，常州越新仪器制造有限公司)；微量进样器(100μL，上海高鸽工贸有限公司)；紫外可见分光光度计(Spectrumlab 752Pro，上海棱光技术有限公司)；冷冻干燥机(LGJ-12，北京松源华兴科技发展有限公司)；恒温摇床(ZQTY-70，上海知楚仪器有限公司)。

1.2 CNFs/SA复合凝胶球的制备

分别称量4组0.6g海藻酸钠于20mL去离子水中，将装有海藻酸钠和去离子水的烧杯放在65℃的水浴中，充分搅拌1h。搅拌完全后滴入3种不同比例的纤维素纳米纤维，在37℃的水浴中充分搅拌2h，获得海藻酸钠纤维素混合液。其中，CNFs液体的固态药物的占比为1.34%。称量一定质量的IBU，使IBU占混合液中固含量的10%。将IBU分别添加到上述混合溶液中，在磁力搅拌器上充分搅拌2h。

称量5g氯化钙和100mL去离子水，搅拌配制成5%的氯化钙溶液备用。使用微型蠕动泵将混有IBU的CNFs/SA溶液按转速25r·min-1滴加到氯化钙溶液中，采用离子交联法[14]形成载药的海藻酸钙基水凝胶球。样品形成后需在氯化钙溶液中浸泡一段时间使形状保持稳定(见图1、表1)。

图1 实验流程图

表1 实验原料配比

1.3 CNFs/SA复合凝胶球结构表征

用相机记录凝胶球的宏观形貌。 使用日立3 400N扫描电子显微镜对冷冻干燥后的凝胶球断面进行表征，所有样品需喷金处理。样品采用傅里叶红外光谱(FTIR)进行表征，ATR附件，扫描范围为500～4 000cm-1。

1.4 CNFs/SA复合凝胶球的溶胀率

取一定质量的复合水凝胶球，记为Wd，室温条件下，浸入12.5mL的生理盐水中。由少量NaOH调节氯化钠生理盐水的pH为7.4，以此来模拟人体内环境液[15]。从凝胶球浸入溶液时开始计时，按照一定时间间隔将凝胶球从溶液中取出，吸去表面水分并称重，吸水后凝胶球质量记为Ws。溶胀率的计算公式如下

(1)

1.5 体外药物释放性能测试

1)标准曲线的绘制 称量0.02g IBU，放入20mL pH为7.4的溶液中，搅拌之后用微量进样器取样，利用浓度稀释公式将溶液分别稀释成5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL和30μg/mL不同浓度的溶液，转移到容量瓶中，然后用去离子水定容到10mL，摇匀，备用。

所用药品IBU的紫外吸光度最大吸收峰位于264nm处[16]，故选择264nm作为本实验用于测定的波长。对上述浓度的溶液进行测定，横坐标(X)设为浓度，纵坐标(Y)设为吸光度，绘制得到IBU在释放液中的标准曲线，如图2所示。

图2 IBU在释放液中的标准曲线

2)IBU释放量的测试 将载药凝胶球放入含有40mL释放液(pH=7.4)的锥形瓶中，恒温振荡，温度为38℃，振荡速率为30rpm。定时移取3mL的释放液进行吸光度测试。根据标准曲线将吸光度换算成浓度，如图3所示。累积释放量的计算按照公式(2)计算。

图3 药物释放测试流程图

(2)

式中：a为紫外分光光度计吸光度经换算后所得的浓度，μg·mL-1；b为IBU的药物含量百分比，%；c为海藻酸钠载药水凝胶球的质量，mg。

2 结果与分析

2.1 复合凝胶球的宏观形貌分析

图4为不同比例CNFs改性SA复合凝胶球的光学照片。单纯SA载药凝胶球和CNFs/SA复合载药凝胶球均有不同程度的透明。随着CNFs含量增加，凝胶球透明度降低，凝胶球整体呈白色，成型性及力学性能提高。

(a) 0%；(b) 12%；(c) 21%；(d) 35%

2.2 复合凝胶球的微观形貌分析

药物释放前的复合凝胶球微观形貌如图5所示，可以明显地看到凝胶的网状结构。a图是纯SA凝胶断面结构，凝胶孔洞较大，加入纤维素后凝胶的网状结构发生变化，孔隙率增加，网状结构更加规整。但是，随着CNFs含量的增加，大量的CNFs在水溶液中的溶解性变差，CNFs与SA不完全相容，导致水凝胶中出现团聚的CNFs。

(a) 0%；(b) 12%；(c) 21%；(d) 35%

2.3 FTIR分析

利用FTIR对复合水凝胶球的结构进行表征，图6为凝胶各组分(SA、CNFs和IBU)的红外谱图。如图6所示，红外图谱上各个位置的吸收峰分别对应不同的基团，SA在3 385cm-1处的吸收峰对应的是O-H官能团伸缩振动吸收峰，在1 613和1 420cm-1处的吸收峰分别对应-COO-官能团的不对称伸缩振动吸收峰和对称伸缩振动吸收峰。CNFs在3 335cm-1处的吸收峰对应O-H伸缩振动峰，2 901cm-1主要与对称C-H振动有关，1 636cm-1来源于吸收的水。在图6中，CNFs谱图中1 375cm-1、1 059cm-1、666cm-1处分别与C-O和C-OH的平面外弯曲模式、分子间酯键的拉伸振动密切相关；IBU在3 439cm-1和1 720cm-1处的吸收峰分别对应于O-H伸缩振动峰和C=O的伸缩振动峰。

图6 SA、CNFs和IBU的红外光谱图

图7是CNFs/SA和载药CNFs/SA水凝胶球的FTIR谱图，对比两个谱线可知，复合水凝胶球中属于SA的-COO-官能团的对称伸缩振动吸收峰向左移到更大的波长处，且峰强度降低，表明复合水凝胶中Ca2+和-COO-官能团之间存在离子结合作用。另外，CNFs/SA红外图谱中3 400cm-1处的吸收峰为SA和CNFs分子内氢键结合的O-H伸缩振动引起的，当加入IBU后，CNFs/SA凝胶中属于O-H的伸缩振动峰向低波数方向移动，表明IBU的加入造成SA和CNFs分子内氢键的解离，IBU与SA和CNFs之间形成了新的分子间氢键。IBU作为物理交联剂通过氢键作用与CNFs/SA复合，IBU的加入促进了CNFs/SA凝胶网络的构建。

图7 CNFs/SA和载药CNFs/SA水凝胶球的FTIR图

2.4 复合凝胶球的溶胀率分析

基于SA的pH敏感性，研究者对不同pH条件下SA复合水凝胶的溶胀率进行了研究[17-18]。为研究水凝胶球中IBU的释放行为，将未干燥的复合水凝胶球放入pH7.4的生理盐水中浸泡，测试CNFs含量对SA凝胶球溶胀率的影响(见图8)。由图8中曲线可以看到，12h之内，纯SA水凝胶球的溶胀比最高，加入CNFs后水凝胶球的溶胀率略有降低，这是因为CNFs分子中的羟基易形成大量的分子内和分子间氢键，纤维相互缠绕，水分子进入分子链内部相对困难[19]，所以加入CNFs不能增加水凝胶球的溶胀率。但是纯SA水凝胶球在溶胀过程中凝胶网络坍塌较早，凝胶球容易破碎，稳定性最差。加入CNFs后凝胶球的在生理环境液中的稳定性提高。当CNFs含量为21%时，所得CNFs/SA水凝胶球的稳定性最好。从图8中凝胶球的光学照片看出，溶胀后与溶胀前相比，凝胶球体积明显增大，吸水后透明性增加。

图8 不同CNFs含量复合水凝胶球的溶胀曲线和光学照片

2.5 复合凝胶球的药物释放行为研究

1)不同CNFs含量复合凝胶球释药分析 CNFs/SA复合载药水凝胶球在pH7.4的生理盐水中震荡，IBU的释放曲线如图9所示。水凝胶球可以吸收周围的液体介质并膨胀(见图8)，药物在凝胶载体中的活动能力增加，通过扩散作用实现药物的释放。随着释放时间的增加，凝胶的网状结构存在一定程度的坍塌，随后药物的释放是通过释放液对复合凝胶球的溶蚀作用实现[20]。对比图9中4条曲线可知，水凝胶载体对IBU的释放起到缓释作用。随着释放时间的增加，IBU的累积释放量持续增加。纯SA水凝胶球中IBU累积释放量在5～30h内最低。CNFs的加入可以改变水凝胶球载体对IBU的释放行为，随着CNFs含量的增加，IBU的累积释放量增大，当CNFs含量为35%时，IBU释放量的增加已经减慢，与21%CNFs含量的水凝胶球对IBU累积释放量的影响基本相同。此外，从30～36h内的释放曲线可知，随着释放时间的延长，4条曲线越来越接近，IBU在含有CNFs的水凝胶球载体中的累计释放量增加缓慢。 可见， 纯SA水凝胶球的部分溶蚀加速了IBU的释放。然而，在释放液pH值为7.4时，钙交联的海藻酸钠凝胶球的膨胀最小，所以在有限的时间内累计释放量不高。

图9 不同CNFs含量复合凝胶球累积释药量

2)释药后的微观形貌 IBU释放36h后，水凝胶球的微观形貌如图10和图11所示。从图10可知，水凝胶球在释放液中浸泡一定时间后，凝胶网络结构更加清晰，凝胶骨架壁变薄。对比图10中a、b、c和d，含有21% CNFs的凝胶网络最规整，这也验证了CNFs的加入可以提高SA水凝胶球的力学性能，在释放液中的稳定性提高。

(a) 0%；(b)12%；(c) 21%；(d) 35%

图11的a和b图中，凝胶骨架表面可以看到小方块颗粒，通过形貌对比，认为这些颗粒是释放液生理盐水中的NaCl颗粒[21]。随着纤维素含量的增加，NaCl颗粒减少，当CNFs含量为21%和35%时，凝胶骨架表面已看不出NaCl颗粒。实验用到的释放液是NaOH和生理盐水的混合溶液，NaOH用来调整生理盐水的pH。CNFs/SA复合水凝胶球经过释放液的浸泡和冷冻干燥后，CNFs可以在释放液中发生冻融[22]。在较低的温度下，NaOH中的阴离子OH-破坏纤维素纳米纤维之间的氢键。与此同时，阳离子Na+协助断键过程，防止CNFs分子链的重新组合[23]。此过程消耗了Na+的量，使NaCl小方块颗粒减少。

(a) 0%；(b)12%；(c) 21%；(d) 35%

3)IBU释放机理分析 结合凝胶球的溶胀率和释药曲线可得，药物IBU的释放可以分为两个阶段(见图12)：第一阶段，药物释放主要依靠溶胀作用。从图9释放曲线可知，IBU的累积释放量在前5h呈现迅速上升的趋势，12h之后水凝胶球中的IBU累积释放量增加速度减慢，但仍旧保持缓慢释放；第二阶段，IBU的释放主要依靠水凝胶在释放液中的溶蚀作用完成[24]。当水凝胶球的溶胀达到一定阶段后，水凝胶球会逐渐破碎，内部网络结构坍塌，包裹在凝胶载体中的IBU逐步释放。实验过程中发现，纯SA水凝胶球破碎最早。从图8中溶胀曲线得知，纯SA水凝胶的吸水率最大。在相同的时间内，溶胀率大的凝胶球吸水量大，凝胶网络最先坍塌，凝胶球最早破碎。因为浸泡在释放液中的水凝胶球数量及大小不等，所以累计释放量会出现波动，图9中的释放曲线发生多个转折。CNFs的加入可以改善海藻酸钠水凝胶球中IBU的释放行为，IBU的释放仍然按照上述两个阶段实现。虽然在有限的时间内，CNFs可以促进IBU的释放，但由于CNFs和SA混合后形成的凝胶网络规整，CNFs/SA复合凝胶球在释放液中浸泡36h后网络结构仍然清晰，凝胶球破碎较少，所以CNFs的加入可以维持IBU较长时间的释放，实现缓释作用。

图12 IBU释放示意图

由此得出疏水性药物IBU在CNFs/SA复合水凝胶球中的释放机理：首先复合水凝胶球发生溶胀，药物释放；当溶胀达到一定程度时，复合水凝胶球表层网络坍塌，水凝胶球局部破碎，直至水凝胶球被释放液完全溶蚀，药物全部释放。由于阴离子海藻酸钠与阳离子纤维素之间以及纤维素纳米纤维内部的相互作用，CNFs会延长水凝胶球的溶蚀，从而实现药物在CNFs/SA复合水凝胶球中的缓慢释放。

3 结论

采用离子交联技术制备了CNFs/SA复合水凝胶球，以复合凝胶球作为疏水性药物IBU的载体，测试了复合水凝胶球的溶胀率，讨论了IBU释放前后水凝胶球的形貌变化，分析了复合水凝胶球对IBU的缓释作用。CNFs的加入改善了复合水凝胶球的成型性和溶胀性。CNFs含量为21%时复合水凝胶球的网络结构规整，在释放液中的稳定性最好，可以维持IBU在较长时间内释放。CNFs/SA复合水凝胶球有望成为疏水性口服药物载体的理想材料。