内质网应激在缺血性脑卒中发病机制中的作用研究进展

抗晶晶 曹翔

脑卒中是我国居民第一位致残、致死的病因，给家庭和社会带来巨大的负担[1-2]。缺血性脑卒中是卒中最常见的疾病类型，占脑卒中的80%左右，其发病原因一般是由于血栓形成或栓塞堵塞血管造成血流突然中断，进而引发严重的脑功能障碍。因此，治疗缺血性脑卒中最有效的方法是快速恢复脑血流，然而在血流恢复过程中可引起机体发生一系列复杂的病理和生理变化，主要包括氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、免疫炎症以及细胞凋亡等，这一过程被称为“缺血-再灌注损伤”(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)。越来越多的研究表明，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)参与了CIRI的过程，在缺血性脑卒中的发生、发展中扮演重要角色[3]。

内质网是一种交织分布在细胞质中高度分化的细胞器，分为光面内质网和糙面内质网两种，其中糙面内质网在蛋白质的合成、折叠及转运，维持钙稳态等多种细胞生理过程中发挥作用。内质网对细胞环境的变化非常敏感，当蛋白质或者脂质合成障碍、钙稳态失衡时即会引发ERS[4]。在ERS的早期，内质网迅速启动自我保护的防御机制，从而可继续维持细胞内环境的稳定；但当刺激持续且剧烈时，如脑缺血缺氧及随后发生的CIRI则会打乱内质网稳态，造成大量错误的、未折叠蛋白在内质网中聚集，激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，该反应会进一步加重脑损伤，严重时则会引发细胞凋亡[5-6]。UPR是目前研究最为清楚的介导ERS的信号转导通路。现就近年来ERS在缺血性脑卒中发病机制中的作用研究进展进行综述。

1 ERS信号通路中的关键分子

内质网上存在3个功能明确的跨膜感受器，分别是双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like ER-resident kinase，PERK)、需肌醇酶1(inositol requiring kinase-1，IRE1)、转录激活因子6(activating transcription factor-6，ATF6)[7]。在正常生理情况下，PERK、IRE1、ATF6均与内质网伴侣葡萄糖蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)结合，处于失活的状态。当发生UPR时，未折叠的蛋白增多，GRP78与PERK、IRE1、ATF6分离而与未折叠的蛋白结合，这可导致3种跨膜蛋白发生自身磷酸化，从而激活一系列的信号通路。当应激严重时，下游的凋亡诱导蛋白CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)、c-Jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-12(cysteine-containing aspartate-specific proteases-12，caspase-12)等凋亡通路启动，从而消除受损细胞。

1.1 PERKPERK是真核生物中最保守的UPR通路，最先在胰腺中被发现。一旦发生UPR，PERK通过激活下游真核生物起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)来减缓新生蛋白的合成，从而减少未折叠蛋白在内质网上的蓄积[8]。磷酸化的eIF2α又可促进转录激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)以及CHOP等蛋白的表达，引起一系列生理过程[9]。

1.2 IRE1IRE1最先在酵母中被发现，其通过二聚化后磷酸化，继而激活下游多个信号转导分子[10]。最主要的下游分子是X盒结合蛋白1(X-box-binding protein 1，XBP1)，磷酸化的IRE1通过剪切XBP1，一方面可促进GRP78合成，另一方面可加速内质网蛋白降解，从而减少未折叠蛋白积累。IRE1还可通过与肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2，TRAF2)物理结合，激活JNK和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，引起细胞凋亡和炎症反应，参与多种疾病的发生和发展[11]。

1.3 ATF6在ERS状态下，ATF6同时被活化，激活的ATF6从内质网转运到高尔基体并被蛋白酶S1P和S2P降解，活性剪切后的ATF6进入细胞核增强内质网伴侣蛋白的转录，从而对未折叠蛋白进行降解[12]。与此同时，ATF6还可参与IRE1通路以及激活CHOP等引发细胞凋亡。

由此可见，适度的ERS是细胞对外界刺激的一种反应，通过启动UPR以及下游一系列井然有序的信号通路对细胞进行保护。但过度的ERS会导致内质网的功能失常，UPR进一步启动细胞凋亡、炎症等破坏程序促进疾病进展，导致预后不良。

2 ERS参与缺血性脑卒中发病的机制

2.1 介导凋亡反应参与缺血性脑卒中ERS介导的细胞凋亡是有别于线粒体损伤途径(内源性途径)和死亡受体活化途径(外源性途径)的一种新的凋亡方式，但此三者间相互联系，形成了一个完整的凋亡网络。CHOP、JNK和caspase-12被认为是ERS中的3条主要凋亡通路。

研究发现，缺血性脑卒中发生后PERK与分子伴侣蛋白GRP78分离，之后PERK磷酸化激活下游CHOP促凋亡信号[13-14]。CHOP是ERS介导细胞凋亡的标志蛋白，研究表明CHOP能够下调B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)编码的抗凋亡蛋白Bcl-2和其相关的x基因编码的促凋亡蛋白Bax的比值，并且促进caspase-3的切割，从而增加脑缺血后ERS和氧化损伤[15]。Split1多毛增强子(hairy and enhancer of split 1，Hes1)是神经系统中非常重要的一种转录因子，Hes1基因敲除可加重缺血性脑损伤，其机制与PERK/eIF2a/ATF4/CHOP诱导的凋亡有关[16]。缺血后脑组织中的谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平显著降低，导致活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平增高，ROS是ERS的强诱导剂，可明显诱导神经细胞凋亡。γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-glutamylcysteine，γ-GC)是GSH的直接前体物质，体内外研究证实γ-GC可显著减少缺血性脑损伤和神经元细胞的凋亡，转录组学研究结果提示这一过程与γ-GC抑制CHOP介导的凋亡有关[13]。磷酸二酯酶(phosphodiesterase 4，PDE4)的抑制被认为可减少缺血后神经元的凋亡，然而其内在的机制尚不清楚。Xu等研究发现，药理性抑制PDE4可减少ROS生成，降低受损神经元中过度的ERS，这一脑保护过程与PERK/eIF2a/CHOP通路密切相关[17]。

IRE1是ERS介导凋亡的另一个重要媒介，UPR发生后IRE1与TRAF2结合进而激活下游JNK蛋白，活化的JNK被转移到细胞核，诱导下游凋亡基因和配体蛋白(如FasL和TNF-α)的表达，最终以转录依赖的方式启动死亡受体凋亡途径。此外，在缺血性脑卒中动物模型中发现，JNK与CHOP的作用类似，也可通过上调促凋亡蛋白的表达、抑制抗凋亡蛋白的活性来介导线粒体凋亡途径[18]。褪黑素已显示出对中枢神经系统的潜在保护作用，CIRI可显著引起ERS和自噬。近期研究发现褪黑素通过抑制IRE1介导的细胞凋亡缓解神经功能缺损程度[19]。罗氟司特是FDA批准的治疗慢性阻塞性肺疾病的药物，近来研究发现其还可以通过减少小鼠脑梗死体积、降低神经功能评分以及减低IRE1和JNK的磷酸化水平发挥缺血性脑损伤的保护作用[20]。

caspase-12一般以非活性的形式定位在内质网的外膜，仅在ERS的过程中被激活。脑缺血发生后，会引发神经细胞内的钙稳态失衡，过量的钙离子会切割内质网膜上的caspase-12前体蛋白，造成caspase-12被激活并释放到细胞质中，进而激活下游caspase-9和caspase-3，诱导凋亡。已有研究证实，永久性和暂时性的缺血性脑卒中小鼠模型均存在caspase-12的激活，同时caspase-12阳性的神经元细胞存在更多的DNA断裂与损伤，而caspase-12基因缺失的小鼠能够抵抗ERS诱导的细胞凋亡[21]。体外细胞实验亦证实氧糖剥夺处理可导致神经元细胞caspase-12的激活。研究发现，脑缺血后侧脑室注射JNK的抑制剂SP600125不仅可抑制脑组织JNK的激活，还可减少caspase-12的切割，表明JNK也参与了caspase-12的活化[22]。de la Cadena等对体外海马神经元进行氧糖剥夺处理后还发现，抑制细胞内caspase-7和钙蛋白酶可以显著减少caspase-12激活，提高神经元的存活[23]。基础研究发现的caspase-12诱导的细胞凋亡机制是否与人类类似仍有争议。有研究结果显示，人体内的caspase-4与啮齿动物的caspase-12具有高度的同源性，同样定位于内质网的膜上，人神经母细胞瘤细胞经ERS诱导剂处理后发生切割并激活，小干扰RNA敲低该细胞中caspase-4的表达，可减少ERS诱导的细胞凋亡[24]。

2.2 介导炎症反应参与缺血性脑卒中炎症反应在缺血性脑卒中的发病机制中起重要作用，过度的炎症反应会促进神经元凋亡加重脑损伤。小胶质细胞是中枢神经系统固有的免疫细胞，介导缺血性脑卒中后的炎症反应[25]。NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路被认为是与脑缺血后小胶质细胞炎症反应最为相关的通路，且受ERS的多重调控。

当细胞处于静息状态时，NF-κB与其抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)结合共定位于胞浆中，一旦激活，IκB磷酸化后泛素化降解，NF-κB被释放、磷酸化后移位进入细胞核调控靶基因的转录。当ERS发生时，活化的IRE1招募IκB激酶(IκB kinase-alpha，IKK)在内质网的附近形成IRE1-IKK-TRAF2三元复合物，导致IκB的磷酸化和泛素化降解，从而促进NF-κB进入细胞核特异性结合在多种促炎因子的启动子或者增强子区，造成如白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6和TNF-α的大量表达，诱导神经细胞死亡[26]。此外，针对炎症性肠病的研究发现，抑制肠上皮细胞中ATF6信号通路也可显著减少NF-κB的激活及下游炎性细胞因子的表达[12]。ROS是ERS的强诱导剂，已被证实可激活NF-κB。Pan等研究发现了一种新颖的化合物Xyloketal B，可通过抑制ROS激活的NF-κB促炎信号减轻缺血性脑卒中模型小鼠的神经功能缺损[27]。

JNK是MAPK信号通路的一员，研究发现IRE1诱导的JNK激活不仅参与凋亡的传导，还可以介导炎症反应。JNK活化后可以通过激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)促进多种炎性因子的转录。抑制MAPK信号通路可以减轻动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)中的ERS和炎症反应[28]。一般而言，缺血性脑卒中的炎症反应和ERS是双向的，不仅ERS可诱导炎症、促进炎症因子释放，反过来炎症因子也会加速ERS的激活，导致更重的炎症反应发生。

2.3 ERS参与AS的发生和发展AS是动脉壁的一种慢性代谢性病变，以脂质沉积和持续的无菌性炎症为主要特征，可引起相应动脉的狭窄或血栓形成，从而导致缺血的发生。AS被认为是缺血性心脑血管病变的基础，也是缺血性脑卒中最重要的危险因素。最近研究表明，ERS是AS发生和发展中的一个重要过程[29]。

当血管内皮细胞受损后，血管的通透性增加，内皮下的巨噬细胞内化脂蛋白颗粒后变成泡沫细胞，将导致内皮细胞进一步损伤，随后大量的泡沫细胞沉积在血管内膜中是AS的初始因素。Su等研究发现，靶向抑制内皮细胞内的血管生长素可明显升高ERS并增加黏附分子的表达，这些变化加速了AS的病情发展[30]。另一项研究发现，敲低内皮细胞中的布鲁顿络氨酸激酶可通过降低ERS程度抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞的炎症反应[31]。一项临床研究通过对颈动脉内膜切除术取得的斑块进行免疫组织学染色发现，ERS标志物GRP78和CHOP的表达与临床斑块不稳定性显著相关，同时斑块内的巨噬细胞和平滑肌细胞中也检测到了ERS标记蛋白的高表达[32]。此外，动物模型发现补充芝麻醇或者银杏叶提取物可以通过抑制ERS减轻AS[33-34]。上述研究均证实ERS参与并促进了AS的发生和发展。

3 总结和展望

综上所述，缺血性脑卒中后ERS相关通路会发生激活，其下游各种蛋白和转录因子受脑损伤程度以及持续时间不同的影响而在脑组织神经细胞的损伤中发挥不同作用。轻度的ERS具有神经保护作用，而过度的ERS则促进神经细胞凋亡、炎症反应、AS的发展，加重脑损伤。因此，ERS可作为缺血性脑卒中的干预靶点，更好地了解ERS涉及的多种机制，将为缺血性脑卒中提供新的预防途径。

与此同时，在缺血性脑卒中的发生和发展过程中，如何利用ERS的保护功能、抑制过度应激的产生，这对提高疾病的预后至关重要。目前尽管一些具有抑制ERS功能的药物，如褪黑素[19]、罗氟司特[20]等在缺血性脑卒中动物模型中已被证实有效，但其在临床试验中的研究却很少。因此，针对ERS各个关键蛋白研发新的、有效的靶向阻断剂将是脑卒中患者和神经科医生所迫切希望看到的，这些将成为今后ERS在缺血性脑卒中研究的重点。