水牛乳β-酪蛋白基因多态性与消化性能及抗氧化性能的关联研究

赵烜影，郭鸰，任大喜，李楠，李玲，刘振民

（1.乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200072；2.东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150038；3.浙江大学动物科学学院奶业科学研究所，杭州 310058；4.中国农业科学院广西水牛研究所，南宁 530002）

据FAO统计，2019年世界水牛乳年产量约1.34亿t，占牛乳总产量的15%，仅次于荷斯坦牛乳。由于水牛乳的乳脂、乳蛋白等主要乳成分与荷斯坦牛乳存在较大差异，使得水牛乳在生产、加工和消费上占有一定优势[1]。我国水牛乳多直接用于鲜乳加工，缺乏水牛乳深加工的基础研究，需要挖掘其营养价值并提高利用度[2]。

酪蛋白是一种主要的乳蛋白，存在多态性[3]。酪蛋白的多态性主要是由氨基酸的缺失或置换以及糖基化、磷酸化位点的差异引起的[4,5]。β-CN作为水牛乳中含量最高的酪蛋白（35.4%），因能分解多种功能性多肽而得到研究者们的重视，它被认为是具有免疫刺激和ACE抑制活性的肽的潜在前体[6～10]。蛋白消化程度会影响释放出的功能多肽[11]，乳蛋白水解产物的抗氧化能力根据多肽的大小和特定的氨基酸序列而有所不同[12]。

目前国内关于水牛乳酪蛋白基因多态性的研究较少。本试验通过分析β-CN基因多态性对消化性能和抗氧化性能的影响，寻找中国常见品种水牛乳β-CN的优势等位基因，以期为功能性乳制品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 水牛乳中β-CN基因多态性分析及纯化

收集中国农科院广西水牛所牧场内160头泌乳中期、6胎以内的水牛（包括摩拉46头、尼里26头、杂交品种88头）乳样。采用安捷伦1260型液相色谱仪，根据Bonfatti等的方法对β-CN基因型进行判定，并采用DEAE Bestarose Fast Flow阴离子交换色谱柱，使用GE AKTA Pure蛋白质层析纯化系统对β-CN基因型为AA、BB及AB的水牛乳样进行分离纯化[13,14]。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其进行分析，确定蛋白类型及纯度。使用1-Labscale小型切向流超滤系统配合截流量为10ku的Pellicon XL超过滤膜对过0.22μm滤膜的收集液进行脱盐处理。

1.2 消化性能测定

消化性能测定参考Lisson等的方法[15]。将AA、AB和BB三种基因型的β-酪蛋白溶解在模拟胃液配成20mg/mL的消化液。加入胃蛋白酶(2000U/mg蛋白)后放入37℃恒温水浴振荡器。分别在消化的0min(胃0)、15min(胃15)、30min(胃30)和60min(胃60)四个时间点取出在沸水加热灭酶。60min后加入等体积的模拟肠液，调节pH值至7.0。加入胰蛋白酶(120U/mg蛋白)继续在37℃恒温水浴振荡器内消化。在消化的0min(胰0)、30min(胰30)、60min(胰60)和120min(胰120)四个时间点取出在沸水加热灭酶。将8个时间点取出的消化液调节pH值至7.0，进行SDS-PAGE电泳分析，比较三者的体外消化性能。

1.3 抗氧化性能测定

1.3.1 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力的测定参考Devendra等的方法并稍加修改[16]。取样品溶液2mL和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL，震荡摇匀，室温避光静置30min，以无水乙醇为空白，于517nm处测定吸光值。吸光值越小代表清除DPPH能力越强。计算公式为：

式中，AS为样品溶液对应的吸光度值；Ab为超纯水(0mg/mL)对应的吸光度值。

1.3.2 对羟自由基清除能力测定

对羟自由基（·OH）清除能力的测定参考陈伟等的方法[17]。取样品溶液0.5mL，9mmol/L的FeS04溶液0.5mL，8.8mmol/L过氧化氢0.5mL，摇匀静置10min。随后加入9mmol/L的水杨酸溶液0.5mL，摇匀37℃静置30min，然后用多功能酶标仪检测510nm处的吸光值(Ai)。另取两管做空白(AC)和样品对照(Aj)，同样条件下测定吸光值。计算公式为：

式中，Ai为提取液和水杨酸混合溶液的吸光值；Aj为提取液和空白溶液的吸光值；AC为水杨酸溶液与混合溶剂溶液的吸光值。

1.3.3 还原能力测定

还原能力的测定参考林燕和张艳萍等方法[18,19]。取样品溶液0.25mL，加入PBS缓冲液B和K3Fe(CN)6(1%，w/v)各0.625mL，混匀后50℃水浴中反应20min，用流水速冷后加入三氯乙酸(10%，w/v)0.625mL混匀，300g离心10min，取上清0.75mL加FeCl3(0.1%，w/v)0.1mL和0.5mL超纯水摇匀，在700nm处检验溶液的吸光度。吸光度值越高，表明样品还原能力越强。

1.4 数据统计分析

以上试验过程中的数据结果采用SAS 9.2软件的MIXDE程序单因素模型统计分析。所用模型如下：

式中，Y为所测指标(DPPH自由基清率、对·OH自由基清除率、还原能力）；G为基因型固定效应（i=1、2、3，分别代表AA、AB、BB基因型）；H为胎次效应（j代表1～6胎）；e为随机残差。

2 结果与分析

2.1 水牛乳中β-CN基因多态性分析

本试验检测到水牛乳中β-CN的A和B两种等位基因，发现了AA、AB和BB三种基因型，结果见表1。本试验结果与Ramesha等[20]通过PCR-RFLP分析印度水牛β-CN基因多态性发现有两种等位基因的研究结果一致。

表1 β-CN基因多态性与基因型统计结果

2.2 β-酪蛋白消化性能分析

模拟胃消化电泳图见图1，由图可知样品到胃液消化60min时，AB基因型消化比较完全，AA基因型的消化速率略快于BB基因型，但是两种基因型的β-CN都没有完全被消化。这与Petrat等通过对荷斯坦牛β-CN的不同基因型进行模拟体外肠胃消化结果一致[21]。

图1 胃液水解样品SDS-PAGE结果

模拟肠消化电泳图见图2，由图可以看出在体外肠消化60min之前，AA基因型就完全水解，到体外肠消化120min前，BB基因型也完全水解。可以认为A等位基因更利于水牛乳在肠道中消化。Dupont等发现在胃消化结束后β-CN完全消化，这与本试验的AB基因型结果一致，但是该研究在60min的肠消化结束后仍有酪蛋白没有被完全消化，这可能是肠消化时间较短造成的[22]。

图2 肠液水解样品SDS-PAGE结果

本试验分离的β-CN三种基因型在经过60min模拟体外胃消化以及120min模拟体外肠消化后均全部水解，其中AB基因型>AA基因型>BB基因型的消化率，BB基因型最难消化。这可能是基因突变导致蛋白的酶解位点和空间结构的改变，进而导致了酶解的速率差异。

2.3 β-酪蛋白抗氧化性能分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力分析

三种基因型的水解产物均具有一定的DPPH自由基清除能力，且在消化过程中有着相同的变化趋势，均在胃60出现了最大值。在整个消化过程中，AA基因型的DPPH自由基清除能力一直高于BB和AB基因型，具体的差异性见图3。在胃30～60这两个时间段内AA基因型的DPPH自由基清除能力显著高于BB基因型（P<0.01），其余时间段两者没有显著差异。综上可知，AA基因型DPPH自由基清除能力优于BB与AB基因型。

图3 水解时间对DPPH自由基清除率的影响

2.3.2 对羟自由基清除能力分析

对·OH清除能力在肠消化阶段急速增加，可以推测具有较强·OH清除能力的肽段是在胰蛋白酶的作用下被水解出来。由图4的具体差异可知，在肠液消化阶段三者都具有明显的·OH清除能力，B等位基因的·OH清除能力均显著强于A等位基因(P<0.05)。

图4 水解时间对·OH清除率的影响

2.3.3 还原能力分析

三种β-CN基因型的还原性在胃60时达到最大值，可以认为胃蛋白酶更有利于还原性多肽的释放。整个消化过程中，BB基因型的还原性一直高于AA基因型型，两者之间的具体差异见图5。在胃30-胰30这个时间段三者有显著的组间差异（P<0.05），可以认为B等位基因的还原性要强于A等位基因。注：标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)；标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。

图5 水解时间对还原能力的影响

目前还没有充足的研究证明，通过胃蛋白酶分解或者用乳酸发酵剂分解的酪蛋白可以产生具有强效抗氧化活性的肽[23]。但是α-CN的水解产物显示出了抗氧化潜力、自由基清除活性、抑制酶和非酶脂质的过氧化作用[24]。杜枘宣发现酪蛋白的DPPH清除率在模拟胃消化120min时达到了最大值46.4%，之后DPPH清除率开始下降[25]。这与本试验发现DPPH清除率在胃消化阶段逐渐增加一致，但是本试验只模拟了β-CN在60min时胃液消化的情况，因而导致消化率不一致。Shanmugam等通过对比用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或多种酶组合消化酪蛋白释放的多肽抗氧化性质发现，胃蛋白酶-胰蛋白酶水解物的Trolox当量抗氧化能力最高。胃蛋白酶-胰蛋白酶水解产物中分子量小于1KDa的多肽具有最高的抗氧化活性[26]。马玲等研究不同菌种作用后干酪对羟自由基的清除试验时发现，清除能力随时间呈现出先升高后降低的趋势，在成熟50d时，清除能力最强达到41.31%，这与本试验发现β-CN的对羟自由基清除率先增后降的趋势一致[27]。

综上试验结果可以得出，消化酶解有利于提高β-CN的抗氧化性能，后续在功能性乳制品研发过程中可以筛选B等位基因的原料乳开发相应的高品质乳品。

3 结论

本研究结果显示，160头水牛乳中β-CN基因有A和B两种等位基因。消化性能结果显示A等位基因有利于β-CN在肠道的消化，抗氧化性结果显示A等位基因的DPPH清除能力要优于B等位基因，但在·OH自由基清除能力和还原性能力上B等位基因更有优势。β-CN基因多态性与体外消化功能和抗氧化活性的不同密切相关。后期可以依据本试验结果以β-酪蛋白的A、B等位基因为标记，为水牛业的定向育种以及精准开发水牛乳功能性乳制品提供理论基础。