系统性红斑狼疮合并动脉粥样硬化动物模型及其发病机制研究进展①

杨 月 刘一凡 薛 鸾 （上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院风湿科，上海 200437）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是由自身免疫介导的，以免疫性炎症损伤为特点的结缔组织疾病，由于细胞和体液免疫功能障碍，产生多种自身抗体，其炎症损伤可累及皮肤、浆膜、关节、肾脏及中枢神经等全身多个系统及器官，临床表现多样，病情变化多端。全身不同程度的血管炎作为其发病的病理基础，主要表现为各种免疫复合物在血管壁沉积，从而激活补体系统，引起发病。

近年研究发现，心血管病变是SLE 常见的并发症，其中又以冠状动脉粥样硬化性疾病为主，其是导致SLE患者死亡的重要原因之一［1-2］。SLE合并早发的动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发病机制目前并不明确，传统危险因素并不能完全解释其发病，因此，建立合适的SLE 合并AS 的动物模型并深入研究其可能的发病机制就成为研究的重点。本文就现有的常用SLE 合并AS 的小鼠模型做一简要阐述（总结如表1）。

表1 SLE合并AS小鼠模型Tab.1 Mouse model of SLE with AS

1 杂交纯化模型

lpr 和 gld 品系小鼠分别在 Fas 和 FasL 基因位点上存在突变，而Fas/FasL 信号通路是调控细胞凋亡的信号通路之一，从而导致大量的淋巴细胞异常增殖，出现与人类SLE 相似的特异性自身抗体［3-4］。以C57BL/6 为背景的载脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠（ApoE-/-mice）和低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）基因敲除小鼠（LDLr-/-mice）是目前用来研究AS 的经典动物模型［5］。ApoE 是一种富含精氨酸的碱性蛋白，具有调节胆固醇和脂蛋白代谢的功能。因此，ApoE基因的缺失能够导致含有胆固醇的物质在血管中不断积聚，最终形成AS。LDLR 是一类单链糖蛋白膜受体，主要功能是介导血浆中富含胆固醇的低密度脂蛋白进入胞内代谢分解，清除血管中的多余脂质，LDLR 功能异常将导致体内脂代谢紊乱。因此，通过将SLE 和AS 两种模型的小鼠杂交纯化从而获得同时具备SLE 和AS 表现的小鼠模型就被率先提出。

最早在 2004 年，APRAHAMIAN 等［6］首先将同是C57BL/6背景的ApoE-/-和gld小鼠交配，选取其中的 4 种纯合子基因型：ApoE-/-、gld、gld. ApoE-/-以及ApoE+/+gld+/+（WT）。虽然 gld. ApoE-/-小鼠的高胆固醇血症较ApoE-/-小鼠轻，但gld. ApoE-/-小鼠的主动脉斑块面积较ApoE-/-小鼠明显增多。gld.ApoE-/-小鼠不仅ANA、aCL 和IgG 的水平较其余3 组明显升高，同时脾肿大和淋巴结增生、肾小球体积增大和蛋白尿的生成也较其余3组严重。以上表现在高脂饮食时更明显。gld. ApoE-/-小鼠在动脉斑块、淋巴结、血液中均可见凋亡核碎片增加，但在淋巴结检查发现吞噬凋亡碎片的巨噬细胞数量明显下降。该模型的发病机制可能与凋亡物质增加而巨噬细胞吞噬功能不足有关，可见，凋亡细胞清除障碍同时加重了该模型的AS 和免疫表型。王世颖等［7-8］也通过这种方法成功建立了SLE合并AS的小鼠模型，同时发现gld.ApoE-/-小鼠体内内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）数量减少，且骨髓EPCs 黏附、吞噬及促血管生成功能受损，这可能是狼疮伴AS发生的原因之一。WATKINS 等［9］还发现干扰素调节因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）在该模型SLE 合并AS 病变中起到了特殊的调节作用。IRF5缺乏可改善狼疮病情，但可促进AS 和代谢功能障碍。这可能与IRF5缺乏导致的Toll样受体7（TLR7）和 Toll 样受体 9（TLR9）信号下游抗 AS 细胞因子IL-10的减少有关。

辛伐他汀和吗替麦考酚酯治疗均可改善gld.ApoE-/-小鼠的 AS 和免疫表型［10-11］。常规剂量的辛伐他汀不仅对gld.ApoE-/-小鼠主动脉斑块病变范围有缓和的抑制作用（25%），其对免疫的改善更显著，其中淋巴组织增生和脾肿大下降达到66%和48%，ANA 滴度下降57%，蛋白尿和肾小球增生基本恢复正常，其作用机制和调控Th1/Th2 细胞因子平衡相关，抑制促炎因子TNF-α、IFN-γ的释放，促进抗炎因子IL-4、IL-10 的表达，并最终减少凋亡碎片聚集。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）激动剂罗格列酮是一种常用的胰岛素增敏剂，同时具有免疫调节作用。APRAHAMIAN 等［12］研究发现罗格列酮通过诱导脂联素能够降低gld. ApoE-/-小鼠的ANA 水平和肾脏病变程度，减轻AS病变。

与此相似，FENG 等［13］在 2007 年通过将 ApoE-/-和lpr小鼠交配获得了另一种同时具备狼疮和AS的ApoE-/-Fas-/-C57BL/6 小鼠。该模型鼠同时表现为狼疮肾炎、AS 和骨量减少。在该模型中，抗氧化磷脂（OxPL）IgG抗体含量增加与动脉斑块面积、肾小球丛面积呈正相关，与骨密度和骨体积分数呈负相关，提示共享的信号通路可能促进以上3种疾病的发生。

LEWIS 等［14］还使用 LDLr-/-小鼠与 Sle16 小鼠杂交产生了Sle16. LdLr-/-小鼠。Sle16 小鼠又称B6.129chr1b小鼠，是在1号染色体携带一个起源于129 小鼠的间隔［15］。尽管 Sle16 小鼠在血清中具有高水平的自身抗体，肾脏中沉积了高水平的IgG 和C3，但仅表现为轻度增生性肾小球肾炎。在此种易感狼疮背景下，高脂肪饮食不仅会导致Sle16.LdLr-/-小鼠AS斑块范围增加，还会使斑块组成发生质的变化，凋亡细胞增加，抗ds-DNA 抗体、抗ss-DNA 抗体及抗chromatin 抗体滴度升高，从而导致更严重的病变。SLE 加速的AS 和肾脏炎症与免疫复合物的形成和系统补体的耗竭密切相关。高脂血症会增强肾免疫复合物介导的补体沉积和肾炎的发展，而加速AS 的发生与补体的耗竭和凋亡碎片摄取的减少有关。这些结果提示积极治疗SLE患者高脂血症可减少狼疮性肾炎的发生，降低加速AS的风险。

2 诱导模型

Pristane 的化学名是2，6，10，14-四甲基十五烷（2，6，10，14-tetramethylpentadecane）。SATOH 等［16］1995 年发现给非自发性免疫鼠BALB/c 鼠1 次性腹腔注射Pristane 0.5 ml 可成功诱导小鼠狼疮，之后陆续发现非自身免疫性小鼠对Pristane 的易感性普遍存在，其中包括C57BL/6 小鼠［17］。该造模方法小鼠外周血循环产生大量的ANA 抗体、anti-dsDNA 抗体、抗 snRNP/Sm 抗体、anti-Su 抗体等，同时可导致肾小球肾炎、蛋白尿、关节炎等病变，跟人类SLE 具有相似的血清特异性抗体和肾脏免疫复合物沉积，有较好的相关性［18］。目前该方法已成为诱导型狼疮小鼠模型最常用方法，是唯一在IFN-Ⅰ升高特征上与人类 SLE 相似的动物模型［19］。LEE 等［20-21］发现腹腔未成熟的Ly6Chigh单核细胞的聚集是Pristane 处理的小鼠体内IFN-Ⅰ的主要来源，Ly6Chigh单核细胞耗竭后IFN-Ⅰ的表达迅速消失。Pristane 仅通过TLR7 和髓样分化因子88（MyD88）依赖通路诱导IFN-Ⅰ的产生、单核细胞的募集和自身抗体的产生。TLR7 缺失不仅可以消除Pristane 诱导的IFN-Ⅰ产生，还可消除自身抗体的产生，提示TLR7/MyD88/IFN-Ⅰ通路在该模型中发挥关键作用［22］。

近年来，通过AS模型鼠诱导狼疮模型的研究逐渐增多。ZHANG 等［23］对 ApoE-/-小鼠进行腹腔注射Pristane，ApoE-/-pristane 组小鼠出现 ANA、ENA 水平升高和脾肿大，其中包括抗Sm、抗nRNP、抗核糖体抗体，符合SLE 的特征。且ApoE-/-pristane 组小鼠动脉斑块的胶原含量明显下降，凋亡细胞增多。Pristane能够增加AS 斑块的易损性，这与IFN-I 的活化密切相关。

3 骨髓移植嵌合体模型

MOREL等［24］在1996年描述了NZM2410小鼠株中3个主要的染色体区间，分别为Sle1、Sle2和Sle3，它们与狼疮易感性高度相关。STANIC 等［25］将B6.Sle1.2.3三倍同源小鼠的狼疮易感性表型转移到受致命性辐射、AS 易感的LDLr-/-小鼠体内，从而制造骨髓移植嵌合体模型LDLr.Sle。LDLr.Sle小鼠表现出狼疮样病变，以双链DNA 抗体升高和肾脏病变为特征。经过高脂饮食喂养，尽管LDLr.Sle 较LDLr.B6 小鼠出现更为严重的AS 病变，但LDLr. Sle 小鼠的胆固醇和甘油三酯水平却较LDLr.B6 小鼠低，且两种小鼠的血压水平无明显差异，血清肌酐和尿素氮水平与动脉斑块面积无明显相关性，证明除了血脂异常、肾脏病变、高血压，还有其他机制导致了该狼疮易感小鼠的AS 进展。LDLr.Sle 小鼠的斑块部位出现更多的炎症细胞浸润，外周CD4+T 细胞和B 细胞高度活化，出现明显升高的抗氧化低密度脂蛋白抗体和抗心磷脂抗体。

BRAUN 等［26］还发现普通饮食和高脂饮食对于LDLr.Sle 小鼠狼疮表型和加速AS 的出现以及斑块部位增多的CD4+T 细胞、抗氧化低密度脂蛋白抗体和抗β2-GPI抗体的升高均无影响，但高脂饮食喂养的LDLr. Sle 小鼠的死亡率和狼疮病情活动度较普通饮食小鼠明显升高。VAN LEUVEN 等［27］进一步研究发现，尽管阿托伐他汀能明显降低LDLr.Sle 小鼠的胆固醇水平，但其并不能改善LDLr.Sle 小鼠的动脉斑块面积，反而是吗替麦考酚酯能明显降低LDLr.Sle 小鼠的动脉斑块面积，抑制CD4+T 细胞活化和向动脉斑块部位的浸润。而在此时间点上，吗替麦考酚酯对LDLr.Sle 小鼠的抗ds-DNA 抗体滴度和肾脏功能以及肾脏病理并无明显改善，提示吗替麦考酚酯对LDLr.Sle 小鼠AS 的改变并非是其改善肾脏病变的间接影响。以上结果也从另一侧面为SLE 中观察到的加速AS 与自身免疫相关提供了额外的证据。

GAUTIER 等［28］还使用 gld 小鼠的骨髓细胞移植到LDLr-/-小鼠体内制造了另一种骨髓移植嵌合体模型gld→LDLr-/-。gld→LDLr-/-小鼠和wt→LDLr-/-小鼠在血浆脂质、脂蛋白谱以及肾功能和蛋白尿方面均无明显差异，但gld→LDLr-/-小鼠的AS 斑块面积较wt→LDLr-/-小鼠明显升高。可能是由于狼疮病情导致了免疫系统的激活，从而在心血管系统中诱导了炎症反应，并导致内皮细胞活化以及凋亡碎片、巨噬细胞、CD4+T 细胞的聚集，从而加速了AS 病变进展。

4 高脂饮食喂养模型

研究表明，ApoE-/-小鼠体内本身就可能存在异常的免疫反应。ApoE-/-小鼠能够通过提升抗原递呈细胞表面协同刺激信号分子CD40 和CD80 的表达，增强T细胞免疫反应［29］。WANG 等［30］发现ApoE-/-小鼠能够通过下调TLR4 信号通路从而导致脾脏细胞凋亡减轻，促进ANA 和ds-DNA 抗体的产生。同时该团队还发现ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养4 个月后，出现血肌酐和尿蛋白的升高，能自发性地形成血清ANA 抗体和抗ds-DNA 抗体，同时出现脾肿大和增生性肾小球肾炎，IgG、C3 在肾小球沉积，这些疾病特征在雌性小鼠中表现为更明显，与SLE 动物模型Fas-/-小鼠（MRL/lpr mice）极其相似。但不同于Fas-/-小鼠，只有在ApoE-/-小鼠的主动脉内膜观察到AS斑块，动脉斑块内还可以检测到IgG、C3的沉积和巨噬细胞的浸润。以上表现提示ApoE-/-小鼠经高脂饮食喂养后出现了自身免疫炎症和脏器的损伤［31］。

刘丽等［32］试图通过用狼疮模型小鼠（MRL/lpr mice）高脂饮食喂养诱导SLE 合并AS 模型，发现即使予以足够时间的高脂饮食，该模型鼠仍不能表现出明显的高脂血症和AS病变。

除了以上提到的4 种造模方法，通过对ApoE-/-小鼠诱导慢性移植物抗宿主病（cGVHD）（B6.GVH.ApoE-/-小鼠）也成为狼疮合并AS 的造模方法之一［33］。cGVHD 会加剧 AS，同时出现抗 ds-DNA 抗体、抗chromatin 抗体、抗心磷脂抗体及抗氧化低密度脂蛋白抗体升高。但抗体水平没有MRL/lpr.ApoE-/-小鼠（MRL/lpr 小鼠与ApoE-/-小鼠杂交鼠）升高明显，目前该模型研究较少。

综上所述，选择合适的动物模型，并从系统性炎症反应、自身抗体、细胞凋亡、补体耗竭、IFN-Ⅰ、趋化因子等方面进一步探讨SLE 合并AS 的作用机制，可能为临床防治SLE心血管事件带来新的突破。