长链非编码RNA ZEB2-AS1在非小细胞肺癌中的表达及临床病理特征与预后的关系

杜进臣 聂洪鑫 胡尕伟 张 斌 王占鹏 李庆新

肺癌是当前世界范围内发生率最高的恶性肿瘤，且发生率与致死率仍在继续上升[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的近80%。肺腺癌和肺鳞癌是NSCLC的两种主要组织学类型，而肺腺癌已成为近年来最常见的NSCLC组织学类型[2]。尽管近年来临床不断探寻新的治疗方法，但NSCLC患者的总生存率仅为15%左右[3]。因此，深入地了解NSCLC的潜在发病机制，寻找早期诊断及治疗NSCLC靶标基因来提高NSCLC患者的生存率已成为研究重点。长链非编码核糖核酸(long non-coding RNA，lncRNA)在转录、翻译或翻译后修饰等多种生物学过程中发挥重要作用，并参与细胞的增殖、凋亡和代谢等生理过程[4,5]。目前已在多种恶性肿瘤中发现了异常的lncRNA表达，其在不同类型的癌症中作为原癌基因或抑癌基因发挥调控作用[6]。锌指E盒结合同源盒蛋白2-反义RNA 1(zinc-finger E-box binding homeobox 2-antisense RNA1，ZEB2-AS1)是一种新发现的lncRNA。越来越多的研究表明,lncRNA ZEB2-AS1参与、促进多种恶性肿瘤的发生和发展过程，包括胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和肝细胞癌等[7～17]。而关于lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC中的表达研究少有报道。本研究通过观察lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC患者中表达，并分析其表达与患者临床病理特征及预后关系，以期为NSCLC早期诊断及靶向治疗提供理论依据。

材料与方法

1.患者与组织样本：选取2013年1月～2018年3月在中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院普胸外科行外科手术治疗的非小细胞肺癌患者129例，其中男性79例，女性50例，患者平均年龄为62.41±6.13岁。纳入标准：①所有NSCLC患者术前均未接受新辅助化疗/放疗或免疫治疗；②具有NSCLC手术指征，无手术相关禁忌证；③术后病理报告明确证实为NSCLC。排除标准：①临床病历资料不完整；②合并其他恶性肿瘤；③生存时间<3个月；④心脏、肾脏等器官严重损伤者。收集所有患者的肺癌组织和癌旁正常组织，且皆为手术切除新鲜标本，液氮快速冰冻后于-80℃低温保存。根据世界卫生组织对恶性肿瘤的分类，由两名病理学专业医师对所有NSCLC患者的诊断和病理分期进行组织病理学证实。收集患者的临床病理资料主要包括肿瘤分化程度、T分期、淋巴结转移、TNM分期，以及患者一般资料包括年龄、性别、吸烟史等。NSCLC的临床病理分期，参照美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM 分期系统。随访数据使用医院电子病历系统和电话采访进行。本研究已通过中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院医学伦理学委员会审批(伦理审批号：2021KYLL069)，所有患者均被告知并获得书面同意。

2.方法：取-80℃保存标本约50mg在匀浆机匀浆后，按照TRIzol试剂(购自美国Invitrogen公司)的说明书，从NSCLC组织及癌旁正常肺组织中提取总RNA。参照反转录试剂盒(购自北京智杰方远)将RNA反转录为cDNA，通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法检测lncRNA ZEB2-AS1相对表达量(PCR仪购自赛默飞世尔科技有限公司)。lncRNA ZEB2-AS1以GAPDH为内参基因，引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。采用2-ΔΔCT法计算NSCLC患者癌组织及其癌旁组织中lncRNA ZEB2-AS1相对表达量。lncRNA ZEB2-AS1上游引物: 5′-ATG AAGAAGCCGCGAAGTGT-3′，下游引物: 5′-CACACCCTAATACACATGCCCT-3′；GAPDH上游引物: 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物: 5′-TCCACCCTGTTGCTGTA-3′。

3.随访：术后对所有NSCLC患者进行随访，末次随访时间为2020年5月1日，统计总生存时间，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。

结 果

1.NSCLC组织及其癌旁组织中lncRNA ZEB2-AS1表达水平检测结果：通过qRT-PCR检测了129例NSCLC组织和癌旁肺组织中lncRNA ZEB2-AS1的表达水平(图1)。NSCLC组织中lncRNA ZEB2-AS1表达水平显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.001)。NSCLC组织中lncRNA ZEB2-AS1表达的中位数为4.36，将129例NSCLC患者分为低表达组(<4.36，n=68)和高表达组(≥4.36，n=61)。

图1 NSCLC组织和癌旁正常肺组织中lncRNA ZEB2-AS1的相对表达水平

2.根据lncRNA ZEB2-AS1表达水平的分组：分析NSCLC组织中lncRNA ZEB2-AS1表达水平与患者临床病理特征的关系，lncRNA ZEB2-AS1表达水平与NSCLC患者肿瘤分化程度(χ2=9.157，P=0.004)、淋巴结转移(χ2=4.372，P=0.003)和TNM分期(χ2=23.155，P<0.001)显著相关，而与性别、年龄、吸烟史、T分期之间无显著关联(P>0.05)，详见表1。

表1 NSCLC患者lncRNA ZEB2-AS1的相对表达量与其临床病理特征的关系

3.NSCLC组织中lncRNA ZEB2-AS1的表达水平与患者预后的关系：Kaplan-Meier生存分析数据显示，lncRNA ZEB2-AS1高表达组的总生存率显著低于低表达组(P=0.013，图2)。多因素COX比例风险模型分析均显示，lncRNA ZEB2-AS1表达水平与NSCLC患者的总生存率独立相关(HR=1.925，95% CI：1.472～10.663，P=0.036，表2)，表明lncRNA ZEB2-AS1高表达提示NSCLC患者临床预后不佳。此外，多因素COX比例风险模型显示分化程度、淋巴结转移、TNM分期也与NSCLC患者预后有关(P<0.05)。

图2 lncRNA ZEB2-AS1高表达组和低表达组Kaplan-Meier生存曲线lncRNA ZEB2-AS1高表达组的总生存期与lncRNA ZEB2-AS1低表达组比较，P=0.013

表2 NSCLC患者预后的COX单因素和多因素回归分析

讨 论

肺癌是目前世界范围内癌症相关死亡的主要原因[18]。尽管近年来在NSCLC临床诊治方面已取得了卓越的研究成果，但NSCLC早期的临床症状隐匿，缺乏高效的筛查手段，诊疗效果仍不能令人满意。因此，如何早期诊断并预测预后对于NSCLC的临床治疗尤为重要。有研究者发现人体近98%的基因组都将被转录为lncRNA，而只有约2%的RNA被编码为蛋白质[19]。越来越多的研究证据表明，lncRNA在调控人类癌症的发生和发展过程中发挥重要作用，并在NSCLC在内的不同肿瘤中充当原癌基因或抑癌基因[20]。人体组织或血浆中lncRNA的表达水平可用于多种恶性癌症的早期诊断和预后评估。因此，探寻更精准的lncRNA，对某些恶性肿瘤的早期诊断与靶向治疗具有重要的临床价值。

lncRNA ZEB2-AS1是近年来被探寻的新型lncRNA，最早由Zhuang等[21]在膀胱癌的研究中鉴定发现的。Jiang等[22]研究发现，lncRNA ZEB2-AS1在结直肠癌组织和细胞中均呈高表达，促进结直肠癌细胞的增殖及迁移，其研究结果显示lncRNA ZEB2-AS1可显著抑制癌细胞发生上皮间质转化。该实验还发现lncRNA ZEB2-AS1的表达与微小RNA-1025(microRNA-1025，miR-1205)的表达呈负相关，CRKL(CT10 oncogene homolog-like)可能是miR-1205的直接靶点，lncRNA ZEB2-AS1通过调节miR-1205/CRKL通路来促进结直肠癌细胞发生上皮间质转化[21]。

Xu等[9]研究发现，lncRNA ZEB2-AS1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且lncRNA ZEB2-AS1高表达的患者预后较差，表明在胃癌细胞中lncRNA ZEB2-AS1高表达可促进癌细胞增殖与侵袭，并抑制癌细胞的凋亡[9]。Wu等[14]研究发现lncRNA ZEB2-AS1在膀胱癌组织和细胞中也呈高表达，与膀胱癌组织中微小RNA-27b(miR-27b)表达显著负相关(r=0.1688，P<0.05)，lncRNA ZEB2-AS1可通过下调miR-27b表达进而促进膀胱癌细胞增殖。Lan等[15]通过实验发现，与癌旁的正常组织比较，肝癌组织中lncRNA ZEB2-AS1的表达水平更高，而lncRNA ZEB2-AS1的表达还与原发肿瘤的大小、肝内转移、淋巴结转移相关。该实验中Kaplan-Meier生存曲线显示，与lncRNA ZEB2-AS1低表达水平的患者比较，lncRNA ZEB2-AS1高表达肝癌患者的总体生存率和无复发生存率较低。通过调节上皮间充质转化诱导的标志物表达水平，lncRNA ZEB2-AS1的下调可抑制肝恶性肿瘤的生长和转移，可考虑将lncRNA ZEB2-AS1作为肝癌患者早期诊断的肿瘤标志物。

而关于lncRNA ZEB2-AS1在肺癌中的研究却鲜有报道。Guo等[17]研究发现，lncRNA ZEB2-AS1在人肺癌组织中显著上调，而lncRNA ZEB2-AS1能够促进人肺癌细胞的增殖并抑制其凋亡。有研究发现白细胞介素-6(interleukin 6, IL-6)在非小细胞肺癌中上调，并通过激活STAT1/ ZEB2-AS1通路促进了非小细胞肺癌的进展[23]。然而，少有研究探讨lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC中的临床意义和预后价值。本研究通过qRT-PCR检测了129例非小细胞肺癌组织和匹配的癌旁肺组织中lncRNA ZEB2-AS1的表达水平。笔者发现与相匹配的癌旁肺组织比较，lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC组织中的表达水平显著升高，这表明lncRNA ZEB2-AS1可能调控了NSCLC的发生。笔者探讨了lncRNA ZEB2-AS1表达与129例NSCLC患者的临床病理特征之间相关性。本研究结果表明，lncRNA ZEB2-AS1表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期显著相关。Kaplan-Meier生存分析数据显示，lncRNA ZEB2-AS1高表达组的总生存期明显低于低表达组。单因素和多因素COX比例风险模型分析均显示lncRNA ZEB2-AS1的表达与NSCLC患者的整体生存独立相关，这表明lncRNA ZEB2-AS1可能是NSCLC患者的整体生存的独立预后因素，这与Xu等[24]的研究结果一致。

总之，笔者研究发现，ZEB2-AS1在NSCLC组织中表达水平较高，并且其高表达与NSCLC中的肿瘤进展和不良预后相关，ZEB2-AS1可能成为新的NSCLC患者预后判断的分子标志物及潜在的治疗靶点。