年龄及孕周对双胎妊娠孕妇胎儿游离DNA浓度的影响

李珊珊 张 萌 王 威 王 昕 陈玉娇 阴赪宏 王一鹏

随着高龄高危孕妇比例增加和辅助生殖技术的蓬勃发展，近年来，双胎妊娠的出生率从2.2%增长到3.0%，增加了双胎妊娠产前筛查和产前诊断的复杂性和难度[1,2]。由于传统的产前血清学筛查技术对双胎妊娠孕妇胎儿染色体非整倍体筛查能力有限，既往双胎妊娠孕妇多通过侵入性产前诊断排除胎儿染色体病。但传统产前筛查的假阳性率及侵入性产前诊断流产、感染等发生的风险性，给孕妇造成焦虑和恐慌，也降低了孕妇对侵入性产前诊断的依从性[3～5]。近年来随着分子遗传技术的飞速发展，无创产前检测(non-invasive prenatal test, NIPT)等技术受到越来越多的关注和应用。有研究表明，相较于传统的血清学生化指标的产前筛查方法，NIPT检测双胎非整倍体的准确性更高，假阳性率更低，其检测双胎非整倍体的准确性接近于单胎检测[6]。

NIPT检测流程较为复杂，其质量控制影响因素较多，其中胎儿游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)浓度与NIPT的准确性密切相关，为保证NIPT的准确性，cfDNA浓度至少达到4%的最低检测浓度标准[7,8]。本研究拟对笔者医院产前诊断中心进行NIPT的双胎妊娠孕妇就诊及测序数据进行回顾性分析，评价双胎妊娠孕妇进行NIPT的cfDNA浓度可能存在的影响因素。

对象与方法

1.研究对象：回顾性研究2019年1～12月于首都医科大学附属北京妇产医院就诊，接受NIPT的3900例孕妇临床信息，其中双胎妊娠孕妇244例，单胎妊娠孕妇3656例。依据本实验室NIPT的质控标准，当检测样本cfDNA浓度<3.5%时，判断为不合格，经过孕妇知情同意后进行二次采血检测。当二次采血检测cfDNA浓度≥3.5%，判为合格，并以二次采血样本作为检测对象进入之后测序数据分析；当二次采血检测cfDNA浓度<3.5%，判为检测失败，无法得出准确测序数据分析结果。本研究已经通过首都医科大学附属北京妇产医院医学伦理学委员会的批准(伦理审批号：2019-KY-046-01)，依据《孕妇外周血游离胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》,所有参与研究的孕妇均签署知情同意书接受NIPT检测。

2.研究方法：分组回顾性整理归纳双胎/单胎妊娠孕妇NIPT检测的筛查年龄、采样孕周分布，分析不同筛查年龄、采样孕周的双胎/单胎妊娠孕妇cfDNA浓度的差异。

结 果

1.研究对象基本特征：依据本实验室NIPT的质控标准，排除连续两次检测cfDNA浓度<3.5%的样本，即入组分析双胎妊娠孕妇241例和单胎妊娠孕妇对照3639例。双胎妊娠孕妇平均筛查年龄为31.72±3.45岁，平均采样孕周为15.30±1.94周，平均cfDNA浓度为8.84%±3.96%；单胎妊娠孕妇平均筛查年龄为33.14±3.73岁，平均采样孕周为16.19±2.94周，平均cfDNA浓度为8.45%±3.50%(表1)。

双胎妊娠孕妇中筛查年龄25～29岁、30～34岁占比较高，分别为66例(27.39%)和119例(49.38%)；单胎妊娠孕妇对照组30～34岁、35～39岁占比较高，分别为1482例(40.73%)和1369例(37.62%)。

表1 双胎/单胎妊娠孕妇一般资料分析

双胎/单胎妊娠孕妇，采样孕周均集中在12～19周，16～17周占比最高，分别为96例(39.83%)和1022例(28.08%)。

2.双胎/单胎妊娠孕妇NIPT筛查年龄对cfDNA浓度的影响：以不同年龄分组，20～24岁、25～29岁、30～34岁、35～39岁和≥40岁年龄组的双胎妊娠孕妇与单胎的cfDNA浓度比较差异均无统计学意义(P>0.05，图1)。

图1 不同筛查年龄的双胎/单胎妊娠孕妇cfDNA浓度对比

3.双胎/单胎妊娠孕妇NIPT采样孕周对cfDNA浓度的影响：以不同采样孕周分组，12～13周、14～15周和≥20周组的双胎与单胎妊娠孕妇的cfDNA浓度比较差异均无统计学意义(P>0.05)，16～17周、18～19周组的双胎妊娠孕妇cfDNA浓度高于同组单胎(P<0.05，图2)。

图2 不同采样孕周的双胎/单胎妊娠孕妇cfDNA浓度对比

4.双胎/单胎妊娠孕妇NIPT建库成功率对比：244例双胎妊娠孕妇中，7例因cfDNA浓度<3.5%首次采血建库检测不合格，其成功率为97.13%。经知情同意后对首次采血建库不合格孕妇行二次采血建库，4例检测成功，其成功率为57.14%。

3656例单胎妊娠孕妇中，34例因cfDNA浓度<3.5%首次采血建库检测不合格，其成功率为99.07%。经知情同意后对首次采血建库不合格孕妇行二次采血建库，17例检测成功，其成功率为50.00%。

双胎妊娠孕妇NIPT首次采血建库成功率低于单胎(P<0.05)，单胎妊娠孕妇NIPT首次采血建库成功的可能性高于双胎；双胎妊娠孕妇二次采血建库成功率与单胎比较，差异无统计学意义(P>0.05)；双胎与单胎妊娠孕妇NIPT总体成功率比较，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 双胎/单胎妊娠孕妇NIPT建库成功率差异分析

讨 论

中国是出生缺陷高发国之一，出生缺陷发生率为5.6%，每年新增出生缺陷数约为90万例，出生缺陷儿给社会和家庭带来了巨大的经济负担和精神压力[9]。染色体病是造成出生缺陷的重要原因之一，患者常常具有智力低下、器官畸形及性功能低下等一系列临床症状。研究表明，双胎妊娠发生染色体异常和严重并发症的风险明显高于单胎妊娠[10]。传统单胎妊娠的产前筛查是通过血清学生化指标和超声影像学筛查评估胎儿染色体异常的风险性，但双胎妊娠母体血清生化指标水平受多个胎儿的影响，异常值被正常胎儿平均，使其产前筛查方式更具有复杂性，其血清学生化筛查的准确性不如单胎准确，所以临床多采取侵入性产前诊断的方式检测胎儿染色体作为双胎妊娠产前诊断的金标准。不同于传统血清学筛查，NIPT技术具有无创性、检出率高、敏感度高等特点，对双胎妊娠孕妇也有较高的筛查价值，明显优于传统筛查方法。

NIPT检测流程较为复杂，因采样失败、cfDNA浓度低、生物信息学等测序数据质控不合格等均能造成检测失败。其中cfDNA浓度是影响NIPT检测的成功率和准确性重要因素。为保证NIPT的成功率和准确性，cfDNA浓度至少达到4%的最低检测浓度标准。孕妇外周血中cfDNA，是因胎儿细胞通过胎盘进入母体血循环被母体免疫系统破坏，致其DNA以游离的形式存在于母体外周血中。有研究分析，与单胎比较，双胎妊娠孕妇NIPT的cfDNA检测失败受孕妇年龄、孕周、双绒毛膜双胎等因素影响[11,12]。

目前，我国依据《中华人民共和国母婴保健法实施办法》、《产前诊断技术管理办法》及《双胎妊娠产前筛查与诊断技术规范(2021年更新版)》等要求，无论单胎或双胎妊娠，产前筛查的年龄仍按照其适用指征，预产期年龄≥35岁的孕妇推荐进行产前诊断[13～15]。有研究发现，31岁的双胎妊娠孕妇与35岁单胎妊娠孕妇胎儿患染色体非整倍体三体综合征的风险一致，建议修正双胎妊娠产前诊断的年龄[16]。2000年，加拿大妇产科医师协会(Society of Obstetricians and Gynaecologists of Canada,SOGC)发布建议32岁以上的双绒毛膜双胎妊娠孕妇进行产前诊断[17]。根据本研究数据分析显示，双胎妊娠孕妇NIPT检测筛查年龄不同于单胎，主要集中在25～34岁，而单胎妊娠孕妇的筛查年龄主要集中在30～39岁。虽然双胎/单胎妊娠的筛查年龄分布不同，但不同筛查年龄组双胎妊娠孕妇的cfDNA浓度与单胎比较差异无统计学意义，除外≥40岁组，其他不同年龄组cfDNA浓度均可达到8%以上，25～29岁组其cfDNA浓度均值达到9%以上。所以建议对于双胎妊娠孕妇可根据其产前诊断等临床指征及考虑其个人意愿等情况，可选择适当提前NIPT的筛查年龄，以保证NIPT检测的成功率和准确性。

除外个体差异，一般来讲孕妇外周血中cfDNA浓度会随着其孕周增加而增加，与采样孕周呈正相关[18]。本研究中，NIPT检测双胎、单胎妊娠采样孕周均集中在12～19周，其中16～17周占比最高；在不同采样孕周，双胎妊娠孕妇cfDNA浓度均高于单胎孕妇，在不同采样孕周组的cfDNA浓度均已经达到8%以上，达到4%的单胎最低检测浓度标准的2倍以上，且当采样孕周为18周及以上时，其cfDNA浓度均值达到10%以上，为单胎妊娠的同孕周组近1.25倍。故建议以临床指征为基础，对于双胎妊娠孕妇可适当延后采样孕周，保证NIPT检测的成功率和准确性。

有研究发现，NIPT检测孕妇中因cfDNA浓度低而造成检测失败占0.1%～6.1%，与单胎妊娠比较，双胎妊娠的cfDNA检测失败率升高[11,19]。本研究因cfDNA浓度低于3.5%引起双胎妊娠孕妇NIPT的失败率为1.23%，符合2016年我国颁布的《国家卫生计生委办公厅关于有序开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断工作的通知》对检测失败<5%的要求。本研究中，而双胎妊娠NIPT检测首次采血建库成功率低于单胎(P<0.05)，单胎妊娠孕妇NIPT检测首次采血建库成功的可能性高于双胎；经过二次采血后，双胎与单胎妊娠孕妇NIPT总体成功率分别为99.54%和98.77%，差异无统计学意义(P>0.05)，说明对于双胎妊娠，可通过适当延后采样孕周，提高检测的cfDNA浓度以提高NIPT的成功率。

目前临床应用双胎妊娠NIPT检测多是采用孕妇外周血中胎儿游离的总DNA含量作为cfDNA浓度来进行评估，无法分辨出双胎中单一cfDNA所占的比例。但因双胎妊娠的遗传的复杂性，单卵双胎因其相同的遗传背景，适用于4%的单胎最低检测浓度标准；而双卵双胎的遗传物质不一致，而孕妇外周血总游离DNA含量达到最低检测4%的浓度标准时，结果可能被所占比例较大的胎儿结果所掩盖，造成假阳性或假阴性的结果[20]。鉴于双胎妊娠特殊性和其NIPT检测的局限性，应用NIPT作为产前筛查检测时，应充分知情告知双胎妊娠孕妇其技术不能检测所有染色体的异常，不能替代侵入性产前诊断。同时，双胎妊娠孕妇cfDNA个体差异较大，可根据其临床指征，对双胎妊娠孕妇的NIPT筛查年龄及孕周做出适宜选择，适当提前NIPT筛查年龄、延后采样孕周，以减少因cfDNA浓度不足造成NIPT的检测失败。