响应曲面法优化盐溶法提取花生粕蛋白工艺

陈胜兵，张慧敏，金 惠，章纪玲，董 增

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州 234000）

花生是我国重要的油料作物，全国各地都有种植，每年榨油产生的花生粕产量1 000 多万t，资源极其丰富[1]。花生粕是榨油后的副产品，主要成分是碾碎的果仁及一些种皮和壳，花生粕粉整体呈浅棕色或深棕色，有淡淡的花生味。花生粕营养价值高，品质好的花生粕蛋白质含量接近50%，含有人体必需的8 种氨基酸，还有黄酮类、酚类、多糖、三萜类等活性成分及人体必需的矿物元素和维生素，而脂肪含量仅为1%，花生粕是一种高蛋白低脂肪的天然优质食品资源[1-2]。

花生粕较高的蛋白质含量和营养价值可以应用于强化饲料蛋白、强化食品、植物蛋白饮料和发酵食品等，开发潜力巨大。水解后的花生蛋白可以使其致敏性降低，制备的花生蛋白肽还具有清除体内自由基、抗氧化、延长细胞寿命等作用，且消化吸收性好、食品安全性高，可以作为营养强化剂应用于婴幼儿配方食品、运动员食品、减肥食品和医疗食品中[3]。花生蛋白还可以制作花生蛋白饮料，花生蛋白有淡淡的花生香味，水溶性程度高，酶改性后的花生蛋白能够提升其在酸性环境中的稳定性，因此可以用来生产花生饮料[4]。除此之外，花生蛋白还能作为加工炼乳、饼干、面包、牛奶等花生风味食品和饮料的原料。

目前，全球的蛋白质供应中，70%以上是植物蛋白，因为植物蛋白的营养价值与动物蛋白相似，且胆固醇含量低，含有多种氨基酸，除上述外，植物蛋白资源丰富、分布广泛，具有其他蛋白无法比拟的功能特性，开发应用前景十分广阔[5]。蛋白质常用的方法有超声辅助提取、浸出法、碱溶酸沉、水剂法、酶法、膜分离技术等[6]，盐溶法是使用一定浓度的氯化钠溶液为提取剂，氯化钠可以促进蛋白的溶解，来源范围广、价格廉价，提取的蛋白质含量较高，盐提取法被应用于芝麻粕蛋白、牡蛎和辣木叶蛋白的提取中[7-9]。以榨油剩余的花生粕为原料，研究氯化钠浓度、pH 值、料液比、浸提时间和浸提温度对花生水溶性蛋白的提取率影响，并利用响应面法优化蛋白提取工艺，以期更高效地提取花生蛋白质，提高其利用率。

1 材料与方法

1.1 材料料与试剂

试验所用主要原料花生粕购于宿州市榨油厂，将块状花生粕敲成小块后用粉碎机粉碎，常温干燥贮藏，备用。试剂主要有牛白蛋白、考马斯亮蓝（BR）、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙醇等，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 标准曲线的绘制

以牛白蛋白（BSA） 为标准蛋白绘制标准曲线。标准蛋白质溶液：准确称取0.5 mg 牛白蛋白溶于50 mL蒸馏水中，即10 mg/mL 原液，在4 ℃下保存，备用。

考马斯亮蓝G—250 试剂：准确称取100 mg 考马斯亮蓝G—250 试剂，溶于95%的乙醇50 mL 中，加入85%的磷酸100 mL，再加蒸馏水定容至1 000 mL，即得考马斯亮蓝溶液。取7 支试管，分别取标准蛋白质溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，并补充蒸馏水至1 mL，随后向每支试管中加入5 mL 考马斯亮蓝溶液，静置2 min 后于波长595 nm 处测定各组蛋白质的吸光度，并绘制标准曲线[10]。

1.3 单因素试验

蛋白质的溶解度受很多因素的影响，考查了料液比、提取温度、提取液pH 值、氯化钠浓度、温度及时间等5 个因素分别对花生粕蛋白质提取率的影响，探究单因素最佳条件的试验，单因素试验条件确定如下：

（1） 确定料液比。固定温度为60 ℃，pH 值为10，NaCl 浓度0.15 mol/L，时间为60 min。研究不同料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25），对蛋白质提取时影响。

（2） 确定水浴温度。固定料液比为1∶15，pH值为10，NaCl 浓度0.15 mol/L，时间为60 min。研究不同温度（40，50，60，70，80 ℃） 对蛋白质提取的影响。

（3） 确定pH 值。固定料液比为1∶15，NaCl 浓度0.15 mol/L，温度为60 ℃，时间为60 min。研究不同提取pH 值（7，8，9，10，11） 对蛋白质提取的影响。

（4） 确定NaCl 浓度。固定料液比为1∶15，温度为60 ℃，pH 值为10，时间为60 min。研究不同的NaCl 浓度（0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mol/L）对蛋白质提取的影响。

（5） 确定水浴时间。固定料液比为1∶15，NaCl浓度0.15 mol/L，温度为60 ℃，pH 值为10。研究不同提取时间（30，60，90，120，150 min） 对蛋白质提取的影响。

提取结束后，对提取液抽滤，取1 mL 上清液，加入5 mL 考马斯亮蓝溶液，静置2 min 后于波长595 nm 处测定吸光度，带入牛白蛋白标准公式得出粗蛋白含量，根据公式（1） 计算得出蛋白质提取率。

1.4 响应面优化

在单因素试验中基础上，对于盐沉淀法提取花生粕蛋白质工艺试验，选取料液比（A）、盐浓度（B）、pH 值（C）、温度（D）、时间（E） 5 个因素进行响应面优化设计，根据设计条件进一步试验得出结果，进行优化设计和模型的确定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的确定

牛血清白蛋白标准曲线见图1。

图1 牛血清白蛋白标准曲线

标准曲线蛋白质质量浓度Y=0.055 5X+0.059 2，该曲线相关性R2为0.992 2，相关性很高，可以用来测定花生蛋白含量。

2.2 单因素结果

2.2.1 料液比对蛋白质提取率的影响

料液比对蛋白质提取率的影响见图2。

图2 料液比对蛋白质提取率的影响

由图2 可知，在一定范围内，盐溶性花生粕粗蛋白质提取率会随着料液比的增加而升高，在1∶15时蛋白质的提取率最高，为35.25%。随着料液比的持续增加，蛋白质提取率呈现下降趋势，料液比的增加能促进蛋白质溶解，溶剂继续增加，会导致其他可溶性杂质增多，从而影响了蛋白质的溶出和测定。所以料液比1∶15 为最佳条件。

2.2.2 浸提温度对蛋白质提取率的影响

浸提温度对蛋白质提取率的影响见图3。

图3 浸提温度对蛋白质提取率的影响

植物蛋白质对温度的敏感性很高。由图3 可知，在60 ℃之前，蛋白质提取率呈上升趋势，60 ℃后蛋白质提取率呈下降趋势，造成这种现象的原因可能是随着温度升高促进了蛋白质充分溶胀溶解，进一步升高温度会导致蛋白质变性析出，从而使蛋白质提取率下降[11]。在60 ℃时蛋白质的提取率最高为35.19%。

2.2.3 pH 值对蛋白质提取率的影响

pH 值对蛋白质提取率的影响见图4。

图4 pH 值对蛋白质提取率的影响

pH 值的主要作用是改变蛋白质的带电情况，影响蛋白质与溶液之间的相互作用，从而使蛋白质的溶解性发生变化。由图4 可知，在pH 值为7～10 时，蛋白质提取率呈现上升趋势，pH 值超过10 后，提取率下降。可能原因是蛋白质在高pH 值条件下，提取液的黏度变大，不利于分离。碱性变强后花生粕中的有机成分进入提取液，干扰了吸光度的测定。所以最佳pH 值应为10，提取率为35.29%。

2.2.4 NaCl 浓度对蛋白质提取率的影响

NaCl 浓度对蛋白质提取率的影响见图5。

图5 NaCl 浓度对蛋白质提取率的影响

盐溶液浓度对蛋白质的盐溶性溶解度有一定影响。当盐溶液浓度较低时，花生粕中的有机成分不易析出，且使蛋白质表面的电荷增加，蛋白质溶解性增强[9]；而当盐溶液较高时，导致蛋白质溶解不充分，蛋白质变性析出[11]。由图5 可知，盐溶液浓度在低于0.2 mol/L 时，蛋白质提取率越来越高，在0.2 mol/L 时提取率最高，为35.07%，超过0.2 mol/L后，盐溶性花生粕蛋白提取率呈现下降趋势。因此，提取花生粕蛋白最佳NaCl 浓度应为0.2 mol/L。

2.2.5 浸提时间对蛋白质提取率的影响

浸提温度对蛋白质提取率的影响见图6。

图6 浸提时间对蛋白质提取率的影响

浸提时间对花生粕蛋白提取率的影响虽没有其他条件大，但对提取率也有一定影响，溶剂穿越样品颗粒接触蛋白质需要一定的时间。由图6 可知，浸提时间在30～60 min 时，蛋白质提取率增长最快，在60 min 时达到最大值，在60 min 后呈缓慢下降趋势，浸提时间过长，会导致蛋白质的分解及杂质增多。因此，花生粕蛋白质提取的最佳浸提时间为60 min。

2.3 响应面设计及结果

综合分析单因素试验结果，按照上述试验方法选取5 个单因素指标进行响应面设计，选择料液比（A）、盐浓度（B）、溶液pH 值（C）、温度（D） 和时间（E） 进行五因素三水平的响应面分析，得出的花生粕蛋白提取的最优工艺[12]。

响应面优化试验因素与水平设计见表1，响应面设计试验结果见表2。

表1 响应面优化试验因素与水平设计

表2 响应面设计试验结果

利用响应面设计软件Design Expert 8.0.6 对数据进行二次元回归拟合，得到蛋白质提取率与自变量之间的二次多项式回归方程[13]：

回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析

试验模型的F=1 137.46，失拟项0.113 7>0.05 不显著，模型p＜0.000 1，说明试验设计的模型拟合度较好，试验设计可靠。模型相关系数R2=0.997 6，进一步说明模型具有较好的可信度。

因素A、B，因素平方项A2，B2，C2的p 值均小于0.000 1，表明料液比和盐浓度对花生蛋白提取有极显著影响。因素C＜0.01，说明溶液pH 值对花生蛋白质提取率有显著影响。根据F 值，对花生粕蛋白质提取率影响大小的排列顺序依次为料液比>盐浓度>溶液pH 值>时间>温度。

3 结论

由试验可知，响应面设计模拟得到最佳提取工艺为料液比为1∶19.85，盐浓度0.17，pH 值9.87，温度58.26，时间41.8，模拟该条件下的得率为38.92%。考虑到操作的可行性和方便性，选用料液比1∶20，盐浓度0.17 mol/L，pH 值9.9，温度58 ℃，时间为42 min 重新做3 组验证试验，试验得出花生粕粗蛋白的提取率平均值为39.03%，与预测值比较接近，说明该工艺条件合理可行，可用于花生粕蛋白质的提取。