基于网络药理学探讨五苓散治疗脑积水的作用机制

苏 丞，孙双喜，孟苗苗，徐禄玉，万 灿，黄 燕

脑积水是世界范围内最常见的神经外科疾病，脑积水是由于脑脊液的产生和吸收失衡或其通路受阻所致，导致脑脊液充满的脑室扩张和颅内压升高。脑积水通常需手术治疗，但术后并发症较多，复发率较高。目前，内科药物治疗、中西医治疗尚无特效药物，多采用对症干预，其中，甘露醇是最常见的脱水药，但长时间使用副作用大。研究表明，炎症反应与脑积水的发病机制有关[1]。

五苓散是治疗水液代谢异常的基本方，出自《伤寒杂病论》，由茯苓、泽泻、猪苓、白术、桂枝组成，有健脾利水、温阳化气的功效，小便不利、水肿、口渴、体液停留、呕吐、腹泻、头晕、头重等主证表现与神经系统相关疾病脑积水有相同之处。多项研究表明，五苓散对于脑积水及正常颅压脑积水有较好的疗效，同时可减少并发症[2-7]。中药复方具有多成分、多靶点、多通路的特点，且具有整体性和系统性，在干预具有多细胞、多因子共同参与调控的复杂病理生理过程中具有独特的优势[8]。网络药理学利用计算机技术，系统全面地观察药物和疾病之间潜在的关系并进行可视化分析，有助于揭示中药复方的科学内涵、发现药物靶标、传承和发展中医药理论[9]。本研究运用网络药理学方法，系统地阐述五苓散治疗脑积水的作用机制，以期为临床及基础研究提供新思路[10-11]。

1 资料与方法

1.1 成分靶点信息查询 在中药系统药理学数据库与分析平台数据库(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)中检索五苓散中5种中药猪苓、泽泻、桂枝、茯苓和白术的成分，成分的筛选条件设置为口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18。将所获得的成分通过TCMSP数据库和Swisstargets数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch/)获得成分靶点。

1.2 疾病靶点查找 以“Hydrocephalus”为关键词，在基因名片数据库(GeneCards，https：//www.genecards.org/)和 美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行人类基因检索。

1.3 关键靶点筛选及蛋白相互作用(PPI)网络构建 采用R3.6.3软件将五苓散化学成分作用靶点和脑积水相关的疾病靶点进行映射构建韦恩图。存在交集的共同靶点可能是五苓散中活性成分治疗脑积水的关键靶点。将药物疾病共有靶点输入STING数据库(https：//string-db.org/cgi/input.pl)进行PPI网络的构建，将生物种类设定为“homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9)，其余设置均为默认设置，获得 PPI 网络。

1.4 靶点通路注释分析 对筛选出的共同靶基因进行基因本体(GO)功能注释和京都基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，对所预测的化学成分靶点进行富集分析，采用R 3.6.3 软件进行可视化处理，分析五苓散治疗脑积水可能的生物过程和信号通路。

1.5 化学成分-交集基因-通路网络构建 根据上述化学成分的靶点预测结果，采用Cytoscape 3.8.0软件构建药物组-化学成分-交集靶点-通路网络模型。在网络中，用不同的形状表示化学成分、交集基因、映射通路等信息，连接线表示两节点间存在关联或映射关系。

2 结 果

2.1 五苓散成分靶点信息 共筛选出五苓散中5味中药50种类药成分，其中，猪苓11个，白术7个，茯苓15个，桂枝7个，泽泻10个。收集类药成分的靶点信息，其中，猪苓181个，白术124个，茯苓186个，桂枝226个，泽泻183个，去重后共获得五苓散类药成分的作用靶点335个。

2.2 脑积水疾病靶点的筛选及共同靶点PPI网络构建 在GeneCards数据库检索到3 519个相关基因，OMIM-NCBI基因数据库获得70个相关基因，将这两个数据库的基因合并去重之后，获得3 520个脑积水相关基因。采用R软件制作3 520个疾病靶点与335个类药成分作用靶点的韦恩图，获得疾病-类药活性成分共同靶点105个(见图1)。在STRING数据平台输入105个疾病与药物共同靶点，分析后获得PPI作用网络，共获得105个相互作用节点和1 147条相互作用关系(见图2)。

图1 疾病与药物靶点韦恩图

图2 共同靶点PPI网络图

2.3 关键靶点GO生物功能注释 应用R软件中clusterProfiler包对五苓散成分-疾病的105个共同作用靶蛋白进行GO生物功能注释，保留P≤0.01的结果，进行可视化分析，获得GO分析柱状图(见图3)。结果可见，共同作用靶点主要富集在类固醇代谢过程(steroid metabolic process)、小分子代谢过程的调节(regulation of small molecule metabolic process)、对氧化应激的反应(response to oxidative stress)、细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)、生殖结构发育(reproductive structure development)等。

图3 共同靶点GO分析柱状图

2.4 KEGG通路富集分析 应用R软件中clusterProfiler包对五苓散成分-疾病的105个共同作用靶蛋白进行KEGG通路富集分析，保留P≤0.01的结果，进行可视化分析，获得KEGG通路富集气泡图(见图4)。可见，共同靶点主要富集于癌症中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、结核(tuberculosis)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)。

图4 KEGG通路富集气泡图

2.5 构建成分-靶点-通路网络 应用Cytoscape 3.2.1软件，构建出五苓散中药-成分-靶点-信号通路网络拓扑图(见图5)。使用network analyzer功能进行网络特征分析，以度值(Degree)为评判标准可获得较为重要的成分、靶点、通路。详见表1。

图5 中药-成分-共同靶点-信号通路网络图

表1 关键成分信息表

3 讨 论

脑积水是一种常见的神经系统疾病，但其发生原因复杂。研究发现，当脑组织损伤时，炎性细胞的炎性反应诱发室管膜瘢痕、脑室内阻塞，这些物质通过多种机制引起更多的细胞损伤和调亡，而许多抗炎药物的相关研究也表明其对改善脑积水的有效性[12-14]。目前认为，脑积水的形成多为室管膜纤毛的功能障碍、水通道蛋白介导的高效跨膜和跨细胞水转运脑脊液的循环障碍，还有出血后血红蛋白降解物质堵塞脑脊液通路这3个主要原因[15-18]。

五苓散可以治疗的疾病的临床表现主要是水液代谢障碍，表现为头痛发热、口渴、水入即吐、吐涎沫而头目眩晕、短气而咳、小便不利、水气上逆等；脑积水的典型症状为头痛、呕吐、视力模糊、视神经乳头水肿、偶伴复视、眩晕及癫痫发作、血压升高、呼吸紊乱、脑型钠潴留及脑性耗盐综合征等，两者在临床表现上有很大的相同性。研究表明，桂枝具有抗病毒、抗菌、降糖、解热、抗炎、抗敏、抗凝血、抗肿瘤、镇静、抗焦虑、扩血管、神经保护等作用[19-21]。白术的作用集中在胃肠道系统、免疫系统及泌尿系统，具有抗肿瘤、修复胃黏膜、抗炎镇痛、调整水液代谢、保肝、改善记忆力、调节脂代谢、降血糖、抗血小板、抑菌、免疫调节等多种药理作用[22-24]。而茯苓具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[25-27]。泽泻具有利尿、抗结石及肾脏保护、降血脂及保肝、降血糖、抗癌、抗氧化损伤、抗炎、抗补体等多种药理活性[28-29]。猪苓的药理作用包括利尿、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫调节、保肝、抑菌、促进头发生长等[30-32]。

本研究中，通过中药-成分-靶点-信号通路网络拓扑分析后，紫杉林(taxifolin)、儿茶素[(+)-catechin]、表儿茶素(ent-Epicatechin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)为筛选后的主要活性成分，这些成分均来自桂枝。相关研究表明，桂枝提取物通过下调Toll样受体4/髓样细胞分化因子88(TLR4/MyD88)信号通路有效抑制小鼠小胶质细胞(BV2)中脂多糖(LPS)诱导的神经炎症[33-34]。紫杉林具有抗氧化和抗炎作用[35]。儿茶素治疗对创伤性脑损伤大鼠有神经保护作用，这些作用可能是通过干预血脑屏障破坏和过度炎症反应的自我维持过程来实现的[36]。表儿茶素显著刺激脾细胞增殖，可显著增强自然杀伤(NK)细胞的细胞毒作用和巨噬细胞的吞噬功能，具有免疫调节活性[37]。β-谷甾醇通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、核转录因子-κB(NF-κB)通路的激活而影响小胶质细胞的活性从而减轻炎症反应[38]。此外，β-谷甾醇具有抑制血小板Aβ生成的潜在作用，可以改善粉样前体蛋白/早老素1(APP/PS1)小鼠的记忆和学习障碍[39]。故五苓散可能通过上述核心成分的抗炎、抗氧化、免疫调节来治疗脑积水。

在中药-成分-靶点-信号通路的后续分析中，筛选出来的靶点有蛋白激酶 B信号1(AKT1)、白细胞介素6(IL6)、胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、重组人血管内皮生长因子(VEGFA)。丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路在T细胞的发育和存活过程中发挥至关重要的作用，与中枢神经系统的自身反应性免疫细胞有关[40]。AKT1对血管内皮细胞功能和壁细胞覆盖的调节在血管生成过程中对血管成熟有重要作用[41]，AKT1可调节血管张力和缺血诱导的动脉形成[42]。

通过KEGG通路分析可知，五苓散主要通过蛋白聚糖通路来治疗脑积水。蛋白多糖是细胞外基质的主要成分，是一组高度异质的蛋白质，其特征是糖胺多糖类型的特定线性碳水化合物链的共价连接，在细胞表面，这些分子调节细胞因子、趋化因子、生长因子、黏附分子的表达和活性，并作为信号辅助受体发挥作用[43]。蛋白多糖在神经组织发育中的作用因其高度调控的时空表达模式而受到越来越多的关注，其可促进/抑制轴突生长，参与各种前体细胞类型的指定和成熟，调节细胞的迁移、轴突寻路、突触发生和可塑性等行为[44-45]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是细胞外信号向细胞内反应转换的重要桥梁[46]。抑制p38MAPK信号通路可有效改善缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的学习记忆能力和运动功能，减少海马区神经元凋亡，从而促进神经元的恢复[47]。此外，MAPK信号通路对血脑屏障的破坏有预防作用[48]。同时MAPK是缺血性和出血性脑血管疾病的重要调节因子[49]。

综上所述，本研究利用网络药理学的方法与技术，挖掘到五苓散中50种类药性成分及335个潜在靶点，脑积水疾病相关靶点3 520个，其中五苓散-脑积水共同靶点105个，通过对这些靶点进行GO生物过程及KEGG信号通路的富集分析，初步预测出五苓散可能是通过调节AKT1、IL6、CASP3、MAPK3、VEGFA等靶点，调控癌症中的蛋白聚糖、MAPK信号通路、乙型肝炎、结核、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染的信号通路对脑积水进行有效治疗。网络药理学是通过计算机辅助技术研究数据库相关联系得来，得出的结果可作为后续研究的线索，为后续的临床及实验研究提供思路。