液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中氯霉素的不确定度评定
2022-02-16许文娟丁葵英田国宁刘文鹏王洪涛宫小明
许文娟 丁葵英 田国宁 刘文鹏 王洪涛 宫小明
潍坊海关 山东潍坊 261041
氯霉素是一种抑菌性广谱抗生素，用于治疗由伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、流感杆菌、布氏杆菌、肺炎球菌等引起的感染，性质极其稳定，但因对造血系统有严重不良反应，故已严格控制使用[1,2]。2019年12月27日发布的农业农村部公告(第250号)，已将氯霉素列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单[3]。
液相色谱-串联质谱技术灵敏度高、抗干扰能力强，是当前检测氯霉素含量的首选方法[4～7]，如国家标准《GB/T 20756-2006可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法》、《GB 29688-2013食品安全国家标准牛奶中氯霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》等。
测量不确定度是指“与测量结果相关联的参数，它表征了可以合理的赋予被测量的量值分散程度”[8]。任何定量检测工作，都会存在系统误差和随机误差，为了使检测结果更可靠，准确识别这些误差来源，并以不确定度的形式与检测结果一起报告，是必要的[9～11]。CNAS-CL01：2008《检测和校准实验室能力认可准则》规定“开展检测的实验室应评定测定不确定度”。
本研究以《GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》为检测方法，按照CNAS-CL01-G003《测量不确定度的要求》及CNAS-GL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》等文件要求[12,13]，对兽药实验室必须掌握的鸡肉中氯霉素的检测方法，进行了不确定评定，以期为同行业研究者提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
液相色谱-串联质谱仪1290-6460，美国安捷伦公司；
电子天平XS303S，德国梅特勒公司；
移液枪Eppendorf，德国Eppendorf公司；
均质器IKA TA25，德国IKA公司；
振荡器IKA MSI，德国IKA公司；
高速冷冻离心机Eppendorf 5810R，德国Eppendorf公司；
氮吹仪N-EVAP-111，美国Organomation公司。
1.2 样品与试剂
氯霉素阴性鸡肉样品，氯霉素阳性鸡肉样品。
氯霉素标准物质(1 000μg/mL，坛墨)；氯霉素-D5标准物质(100 μg/mL，坛墨)。
1.3 测定方法
本实验鸡肉样品中氯霉素的含量采用《GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》方法测定。
1.4 标准溶液配制
1.4.1 外标标准工作液的配制
吸取购入的1 000μg/mL氯霉素标准储备溶液100μL，以定容液稀释到100μg/mL。继续分别稀释成1μg/mL标准中间液及10ng/mL的氯霉素标准工作液。
1.4.2 内标标准工作液的配制
吸取100μg/mL氯霉素-D5内标10μL，以定容液稀释到1μg/mL，最终稀释成浓度为20ng/mL的氯霉素-D5标准工作液。
1.5 测定
仪器条件按照《GB/T 22338-2008》设定，将标准工作液和样品定容液分别注入高效液相色谱-串联质谱仪中，用校准曲线内标法定量计算氯霉素残留量。本文中用于不确定度评定的氯霉素阳性样品，进行两次平行实验，其称样量及仪器测定结果为：测试1，5.011g，0.5423μg/kg；测试2，5.042g，0.5530μg/kg。
1.6 数学模型
采用内标法定量，按公式(1)计算。
(1)
式中：
C为标准工作溶液中待测组分的浓度，单位为ng/mL；
Ci为样品中内标物的浓度，单位为ng/mL；
A为样品中待测组分的峰面积；
Asi为标准工作溶液中内标物的峰面积；
V为样品定容体积，单位为mL；
Csi为标准工作溶液中内标物的浓度，单位为ng/mL；
Ai为样品溶液中内标物的峰面积；
As为标准工作溶液中待测组分的峰面积；
W为样品称样量，单位为g。
1.7 不确定度来源分析
见表1。
表1 测定鸡肉中氯霉素含量的相对不确定度一览表
从测量过程和数学模型分析，本方法测定鸡肉中氯霉素的不确定度主要来自：测量的重复性、标准物质、标准溶液配制、样品前处理过程(样品称重、最终上机液定容)、校准曲线，其分量符号及来源分析见表1。
2 结果与分析
2.1 A类不确定度(重复性)urel(A)
制备10个空白样品，添加一定浓度的氯霉素标准溶液，进行前处理和上机检测的完整过程，重复测量10次，测量结果见表2。通过标准偏差计算测量重复性引入的不确定度分量。
表2 10次重复测量的结果统计
(2)
按照相对不确定度公式(3)计算，
(3)
2.2 天平称量引入的相对标准不确定度分量urel(B1)
待测样品平行称样量为5.011g和5.042g，按照公式(4)计算相对不确定度：
(4)
2.3 标准物质纯度引入的相对标准不确定度urel(B2)
2.3.1 氯霉素外标引入的不确定度
查询氯霉素标准物质证书，其标准值1 000μg/mL，相对扩展不确定度为2%(k=2)，其相对标准不确定度为：
(5)
2.3.2 氯霉素内标引入的不确定度
查询氯霉素-D5标准物质证书，其标准值100μg/mL，相对扩展不确定度为3%(k=2)，相对标准不确定度为：
(6)
由标准物质纯度引入的不确定度按公式(7)计算：
(7)
2.4 标准物质配制过程的相对标准不确定度urel(B3)
器具最大允差及相对不确定度见表3。
表3 器具最大允差及相对不确定度
购入的氯霉素标准物质为1 000μg/mL液体标准溶液，配制过程无需称量，仅使用移液枪和容量瓶进行逐级稀释。按照《常用玻璃量器检定规程》(JJG 196-2006)[14]、《移液器检定规程》(JJG 646-2006)[15]各器具引入的相对不确定度见表3。
2.4.1 氯霉素外标稀释过程的不确定度
用100μL移液枪吸取1 000μg/mL标准品100μL，用1 000μL移液枪吸取900μL定容液，先后置于1.5mL具塞离心管中，混匀，配制成100μg/mL氯霉素标准溶液。此过程的相对标准不确定度为公式(12)：
(12)
用10μL移液枪吸取100μg/mL标准溶液10μL，用1 000μL移液枪吸取990μL定容液，先后置于1.5mL具塞离心管中，混匀，配制成1μg/mL氯霉素标准中间液。此过程的相对标准不确定度为公式(13)：
(13)
用1 000μL移液枪吸取1μg/mL氯霉素标准中间液500μL，用50mL容量瓶定容至刻度，稀释成浓度为10ng/mL的氯霉素标准工作液。此过程产生的相对不确定度为公式(14)：
(14)
综上，氯霉素标准溶液配制过程的相对不确定度为公式(15)：
urel(B3-1)=
(15)
2.4.2 氯霉素内标稀释过程引入的不确定度
购入的氯霉素-D5内标浓度为100μg/mL，稀释到1μg/mL，产生相对标准不确定度为4.66×10-2(同公式13)。用1 000μL移液枪吸取1μg/mL氯霉素-D5标准中间液1 000μL，用50mL容量瓶定容至刻度，稀释成20ng/mL的氯霉素-D5标准工作液。此过程产生的相对不确定度为公式(16)：
(16)
因此，氯霉素-D5内标配制过程中产生的相对不确定度urel(B3-2)见公式(17)：
urel(B3-2)=
(17)
本实验标准物质配制过程的相对标准不确定度urel(B3)按公式(18)计算：
(18)
2.5 前处理定容引入相对不确定度urel(B4)
上机样品定容使用1 000μL移液枪，产生的相对不确定度按公式(19)计算：
(19)
2.6 校准曲线引入相对不确定度urel(B5)
以标准溶液浓度(c)为横坐标x，氯霉素外标与内标峰面积之比(I)为纵坐标y拟合得到校准曲线，方程为y=21.397258x-0.364913，r2=0.999。校准曲线浓度点及对应的峰面积见表4。
表4 校准曲线浓度及峰面积
按照公式(20)计算校准曲线产生的不确定度，计算过程涉及的参数见表5。
(20)
表5 校准曲线不确定度公式对应参数
(21)
计算得到u(c0)=0.0124μg/kg，由此可按公式(22)计算urel(B5)：
urel(B5)=u(c0)/c0=0.0226
(22)
2.7 合成标准不确定度uc
实验室实际测得鸡肉样品中的氯霉素含量为0.548μg/kg，由公式(23)计算合成标准不确定：
(23)
经计算uc为0.042μg/kg。
2.8 扩展不确定度UP
取置信水平P=95%，包含因子k=2，则扩展不确定度为公式(24)：
UP=k×uc=2×0.042=0.084μg/kg
(24)
2.9 结果报告
本文中鸡肉中氯霉素残留量的测试结果报告为公式(25)：
(25)
3 结论
本实验采用液相色谱串联质谱仪测定了鸡肉中的氯霉素残留量，并评定了整个过程的测量不确定度。结果表明，在氯霉素的测定过程中，对最终测量不确定度贡献最大的是标准物质配制过程，其次分别为校准曲线拟合、测量重复性、标准物质纯度和前处理定容过程，天平称量引入的不确定度在本实验中可以忽略。因此，实际检测中，要采用经过检定的容器进行标物物质的配制和稀释，且尽量减少稀释次数。校准曲线拟合采用6个以上的校准浓度，可以降低不确定度。另外，可通过提高仪器稳定性、实验人员操作稳定性，较少随机误差，降低测定过程重复性引入的不确定度。总之，通过全面评定测量不确定度，可以使报告结果更可信，也可针对不确定度分量大小改进实验过程，提高结果的准确性。
