光照诱导太子参叶片黄化的机制

刘晓峰，查道喜，朱启法，徐方正，陈 洋，张广雨，王学瑛，薛 琳，许立峰，张忠锋，徐海清，张洪博

（1中国农业科学院烟草研究所，山东青岛 266101；2安徽皖南烟叶有限责任公司，安徽宣城 242099）

0 引言

太子参(Pseudostellaria heterophylla)又名童参，属石竹科多年生草本植物，是一种珍贵的中药材，具有悠久的药用历史[1]。在中医药应用中，太子参可用作人参或西洋参的替代品，具有极大的药用价值和经济效益，也是重要的乡村振兴经济作物[1]。太子参是一种典型的喜阴植物，自然条件下多生长于阴湿的林荫地带[2]。由于野生资源日趋匮乏，无法满足市场需求，人工栽培已成为太子参的主要生产方法[3]。

中药材质量优劣不仅与遗传因素有关，也受到环境因素的影响[4]。人工栽培的太子参在大田种植过程中易受到自然界的强光、高温、高湿等环境胁迫[5]。在高温季节，太子参常会发生叶片黄化、腐烂枯苗等提前凋亡现象，给太子参的产量造成了巨大损失。探明太子参在大田种植过程发生叶片黄化及植株凋亡的生理机制可以为生产实践提供理论指导。其他植物的研究表明，光照对植物的叶片黄化起着双向调控作用[6-7]。一方面，光照能够诱导黑暗条件下形成的植物黄化幼苗转绿，进行正常光合作用，也是植物光形态建成的关键调控因子[6,8-9]；另一方面，持续光照或高强度光照会导致叶片脱绿黄化，抑制植物的正常发育[7,10]。光照诱导植物叶片变绿及光形态建成的研究相对深入，其分子调控机制也得到了揭示[6,8]。有关光照促进植物叶片黄化的研究也有不少报道[10-12]，但对其发生机制的了解还非常有限。太子参是一种喜阴的药用作物。据报道，遮阴处理能够在一定程度上缓解大田种植太子参的枯苗现象[13]，但其作用机制仍不清楚。笔者探讨太子参在大田种植过程发生的叶片黄化及植株凋亡与光照强度之间的关联，以期进一步明确光照影响太子参叶片黄化和植株凋亡的机制，为太子参的生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试太子参是安徽省宣城市当地栽培品种。

1.2 主要仪器

实验所用光强照度计购自深圳市华盛昌科技实业股份有限公司（可见光照度计）、北京师范大学光电仪器厂（紫外照度计和蓝光辐照计），淀粉含量测定及显微观察所需化学试剂购自上海生工生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 太子参的田间种植与观察 太子参的田间实验分别在安徽省宣城市及贵州省遵义市进行。于10月中旬深翻土壤后，施足基肥，将太子参种参均匀播种后覆土5 cm，采用常规措施进行田间管理[14]。在3—7月间定期观察太子参的叶片颜色，并取样用于叶片的碳水化合物（可溶性糖及淀粉）含量测定以及显微观察。

1.3.2 太子参的温室栽培 先按照田间种植方式，在实验温室培育太子参苗，后将太子参苗移植于填充了育苗基质的育苗盘中，经过2周的适应性培养后，分别置于100、200、300 μmol/(m2·s)的光照强度（以光强照度计测定）下进行培养，于4周后进行叶片颜色观察，并取样用于叶片的碳水化合物（可溶性糖及淀粉）含量测定以及显微观察。

研究氮素对光照诱导太子参叶片黄化的调控作用时，利用Hoagland营养液、尿素和蛭石配制磷、钾含量一致（磷0.07%，钾0.03%），氮素含量分别为0.12%及2.4%的培养基质，然后，将太子参苗分别移植于2种氮素含量的培养基质中，于光照强度为200 μmol/(m2·s)的实验温室培养。4周后，分别调查不同氮素条件下的太子参苗叶片颜色，并取样进行叶片碳水化合物（可溶性糖及淀粉）含量测定。

1.3.3 太子参叶片的可溶性糖及淀粉含量测定 准确称取0.1 g太子参植株叶片于研钵中研碎，按照植物可溶性糖含量测定试剂盒和淀粉含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）说明书中的步骤，进行可溶性糖和淀粉提取、标准溶液配制、标准曲线绘制，以及样品可溶性糖含量和淀粉含量的计算。

1.3.4 太子参叶片的透射电镜观察 将太子参叶片于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定4 h，以0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次；然后，用1%锇酸固定液固定1.5 h，用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次；依次用50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮脱水，最后用100%丙酮脱水3次；然后，使用Epon812树脂进行样品包埋，并依次在37、45、60℃条件下保存24 h进行固化。使用Reichert-Jung ULTRACUT E型超薄切片机将样品切成70 nm的电镜切片，用铜网捞片，并以醋酸铀-柠檬酸铅双染法染色，最后使用JEM1200电镜观察拍照。

2 结果与分析

2.1 遵义和宣城两地太子参田间生长比较

通过观察贵州遵义和安徽宣城的太子参田间生长情况发现，太子参的叶片在3月出苗到5月中旬的幼苗呈翠绿色，5月下旬后的太子参成苗随着天气温度的增加叶片逐渐变黄，但安徽宣城的情况更为快速、严重（图1A）。此外，宣城的太子参在5月底开始发生大面积烂苗情况，到6月末太子参植株的地上部分基本全部消失（图1A）。贵州遵义的太子参田间烂苗情况较轻，到7月后的收获期太子参整株仍然保持存活状态，但叶片基本全部黄化。气象数据显示，2个地点在3—5月间的最低气温、最高气温、以及相对湿度的差异较小，但安徽宣城在3—5月的阴雨天数量明显比贵州遵义少（表1），即安徽宣城的太子参在这段时间接受了更强的光照；而在6月间安徽宣城的阴雨天数量及气温均高于贵州遵义。基于这些观察数据以及太子参的自然喜阴生长习性，推测宣城太子参叶片的快速脱绿黄化可能与3—5月的光照强度有关，而后期的气温升高和阴雨增加则促进了植株的腐烂凋亡。

图1 遵义与宣城的太子参田间生长情况比较

表1 宣城和遵义的天气因子比较

另一方面，在安徽宣城的太子参田观察发现，凋亡太子参植株的叶片表面大多存在真菌病害的生长痕迹（图1A）。真菌的生长与叶片碳水化合物含量具有很大关联[15-17]，这一现象促使笔者进行太子参叶片的碳水化合物含量测定。对4月下旬及5月下旬太子参叶片的碳水化合物含量检测发现，4月下旬取样的安徽宣城和贵州遵义的太子参叶片在可溶性糖和淀粉含量方面无明显差别，但5月下旬在安徽宣城取样的太子参叶片的可溶性糖和淀粉含量均高于同期在贵州遵义取样的太子参叶片（图1B、1C）。

2.2 温室条件下不同光照强度对太子参叶片发育的影响

光照是影响碳水化合物代谢的关键因子。为进一步分析光照对太子参叶片黄化及叶片碳水化合物累积的影响，在25℃的人工气候室比较了不同光照强度下太子参叶片的发育差异。在实验过程中，太子参苗被分别置于100、200、300 μmol/(m2·s)的光照强度下进行培养，并于4周后进行叶片颜色观察及碳水化合物含量的测定。各光照强度下的紫外光及蓝光水平如表2所示。

表2 温室培养太子参在不同光照下的叶色变化 μmol/(m2·s)

研究结果表明，在光照强度为100 μmol/(m2·s)条件下培养的太子参叶片颜色呈绿色；在光照强度为200 μmol/(m2·s)条件下培养的太子参叶片颜色明显变黄；而在光照强度为 300 μmol/(m2·s)条件下培养的太子参叶片出现脱绿现象，部分叶片甚至完全脱绿（图2A）。碳水化合物含量测定结果（图2B、2C）显示，不同光照条件下生长的太子参叶片中的可溶性糖及淀粉含量存在明显差异。100 μmol/(m2·s)光照条件下培养的太子参叶片中的可溶性糖和淀粉含量均低于10 mg/g；200 μmol/(m2·s)光照条件下培养的太子参叶片中的可溶性糖、淀粉含量约为15、24 mg/g；300 μmol/(m2·s)光照条件下培养的太子参白色叶片的可溶性糖、淀粉含量约为43、90 mg/g。上述结果表明高光照强度在诱导太子参叶片脱绿过程发挥重要作用。

图2 不同光照强度下温室培养太子参苗的生长情况

2.3 强光促进太子参叶片颜色变化的机理研究

为探明光照影响太子参叶片颜色及碳水化合物含量变化的原因，利用透射电镜对安徽宣城和贵州遵义大田种植太子参在5月中旬的叶片进行了显微观察，以比较其结构差异。如图3A所示，与遵义的太子参叶片相比，宣城太子参叶片的叶绿体中的淀粉颗粒明显偏大。随后，利用透射电镜对温室培养太子参在不同光照条件下的叶片结构进行显微观察。如图3B所示，100 μmol/(m2·s)光照条件下培养的太子参叶片（嫩绿色）的叶绿体中的淀粉颗粒少而小，200 μmol/(m2·s)光照条件下培养的太子参叶片（黄绿色）的叶绿体中的淀粉颗粒数量较多且颗粒较大，300 μmol/(m2·s)光照条件下培养的太子参叶片（脱绿）的叶绿体中的淀粉颗粒数量较多且颗粒巨大，导致叶绿体片层消失。上述结果表明，光照强度的增加促进了太子参叶片叶绿体中的淀粉累积，导致叶绿体结构变化，从而引起叶片颜色变化。

图3 太子参叶片的透射电镜观察

2.4 光照诱导太子参叶片黄化过程的氮素调节

为研究利用氮素调控光照诱导太子参叶片黄化过程的可能性，利用磷、钾含量一致（磷0.07%、钾0.03%），但氮素含量不同的培养基质在实验温室比较了太子参在200 μmol/(m2·s)光照条件下的生长差异。在培养3周后，含氮0.12%的培养基质中生长的太子参叶片呈黄绿色，植株相对矮小，单株质量约1 g；而含氮2.40%的培养基质中生长的太子参叶片呈嫩绿色，植株明显高大，单株质量约2.5 g（图4A～B）。碳水化合物含量测定显示，含氮0.12%培养基质培养的太子参叶片可溶性糖、淀粉含量约为38、75 mg/g，而含氮2.40%培养基质培养的太子参叶片可溶性糖、淀粉含量约为7、20 mg/g（图4C～D）。这些结果表明，增加氮素施用量在促进植株生长的同时可降低太子参叶片的碳水化合物累积，并抑制光照诱导的叶片黄化。

图4 不同氮素条件下太子参苗的生长情况

3 结论

研究表明，太子参种植过程中的强光照导致太子参叶片黄化，其发生机制是强光照导致的淀粉累积改变了叶绿体的结构，增加土壤中的氮素含量可以抑制光照引起的太子参叶片黄化发生，该研究可为太子参生产上的农艺措施调控提供一定指导。

4 讨论

野生太子参为多年生植物，其生命周期约为4～7年[18]，而人工栽培的太子参通常在秋末播种，翌年夏末收获，生长周期短，已成为当前市场的主要供给方式[19]。在人工种植过程中，植物叶片的黄化凋亡是影响太子参生产的一大难题。本研究针对这一问题进行了田间调研及生理分析，对光照在太子参叶片黄化过程的作用机制进行了揭示，对太子参的生产实践具有参考价值。

在生产上，安徽宣城种植的太子参极易在夏季发生叶片快速黄化凋亡现象，其产量也远低于夏季叶片黄化较轻的贵州遵义太子参，比较两地的太子参生长差异有助于揭示太子参叶片黄化的发生机制。在比较两地太子参生长的田间差异时，本研究发现光照与太子参叶片黄化存在极大关联。室内试验结果也表明，弱光照射下生长的太子参叶片颜色呈鲜绿色，强光照射下生长的太子参叶片颜色明显变黄，说明光照在太子参叶片黄化中发挥关键作用。前期报道，遮阴处理能够提高太子参叶片叶绿素含量，是防治强光照下太子参枯苗的重要措施[13]，将太子参和其他作物进行套种，种植在乔木林下，或者在太子参田放置遮阳网，以阻止太阳光直射，也可以起到遮荫及增产的目的[1]。这些农艺措施与本研究所发现的光诱导太子参叶片黄化具有高度一致性。

叶片的颜色与内部的叶绿体结构密切相关[20-21]。对太子参叶片的透射电镜观察发现，强光照射下生长的太子参叶片叶绿体中的淀粉颗粒在数量和体积上均得到显著增加，而且强光照还会导致淀粉颗粒完全占据叶绿体，破坏叶绿体结构，引起叶片脱绿。叶绿体是叶片合成碳水化合物的主要场所，光照对叶绿体发育的影响也会引起叶片的碳水化合物含量变化[21]。本研究发现，强光照可以增加太子参叶片的可溶性糖及淀粉等碳水化合物含量。对安徽宣城和贵州遵义的太子参叶片检测也表明，太子参叶片的碳水化合物含量与接受的光照强度呈正比，宣城的太子参叶片在5月前累积了更多的碳水化合物。这些现象说明光照是引起宣城太子参叶片过早黄化的原因，而高水平的碳水化合物累积对高温高湿天气的叶片腐烂起到促进作用。氮素是影响植物叶片发育的重要因子，增加氮肥用量可以改变叶片结构，使叶片变绿[22-23]。本研究证明，高氮素培养基质可以有效抑制高光强导致的太子参叶片黄化，这一结果与前人报道多施肥可以改善太子参生长的结论一致[2,24-25]。

本研究初步分析了光照引起太子参叶片黄化凋亡过程所发生的生理变化和可行的调控方式，在未来的研究中还需要进一步开展分子水平的作用机制解析，为适合人工栽培的太子参品种选育和太子参种植过程的生物调控措施开发提供参考。