微液液提取-气相色谱-串联质谱联用检测葡萄酒9种农药残留

党富民，李自芹，刘长勇，唐宗贵，杨涛，赵志永★

（1新疆农垦科学院分析测试中心，新疆 石河子 832000；2新疆农垦科学院农产品加工研究所，新疆 石河子 832000）

葡萄酒是新鲜葡萄或葡萄汁经发酵而成的饮料，适量饮用还能预防多种疾病，增强体质[1-2]。但是在葡萄生产过程中，大量杀虫剂[3-4]、杀菌剂[5-6]和除草剂[7]等农药喷施会残留在葡萄及葡萄酒中。人长期进食后，就会在体内积累，引起慢性中毒[8-10]。由于葡萄酒产地广泛，各地区使用农药种类不一，加上复配农药的大量使用，使得葡萄酒中农药残留由单一种类向多种方向发展。为保证葡萄酒产品的食用安全，提高我国食品安全监管水平[11-12]，保障公民身体健康，促进葡萄酒产业的发展，研究一种准确、快速、灵敏的葡萄酒中农药残留检测方法是非常必要的。

目前，国内外酒类农药残留前处理方法主要有液液萃取法[13-14]、固相萃取法[15-16]、固相微萃取法[17]等，但这些前处理方法繁琐、成本高，有毒有害化学试剂用量大[18-20]，对环境造成污染大。本文研究了微液液提取（MLLE）技术作为样品前处理方法，使样品前处理简单快捷，省去大量有毒试剂，节约成本，利于环保，适用于液体样品的分析。通过基质匹配标准校正方法补偿基质效应，灵敏度和准确度均满足农残分析要求，方法可用于葡萄酒中农药残留的快速检测。

1 试验部分

1.1 仪器、试剂与材料

7890B/7000C气相色谱串联质谱联用仪（美国安捷伦公司）；N-EVAP111型旋转蒸发器（美国Organomination公司）；TG16-WS型高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；SK型快速混匀器（江苏正基仪器有限公司）。丙酮为色谱纯；乙腈、正己烷、氯化钠均为分析纯；敌敌畏、灭线磷、甲拌磷、甲基对硫磷、毒死蜱、倍硫磷、杀扑磷、三唑磷和伏杀硫磷标准品（纯度＞99.9%）。葡萄酒样品均购自本地超市。

农药标准溶液：9种农药用丙酮配制成标准储备液，再稀释成相应的标准工作溶液，用空白基质溶液稀释配制成基质匹配混合标准溶液。

1.2 色谱条件

色谱柱初始温度：70℃保持1min，然后以30℃·min-1程序升温至130℃，5℃·min-1升温至250℃，10℃·min-1升温至300℃，保持3min；进样量：1μL；进样方式：不分流进样；柱流量：1.2mL·min-1（恒流模式）；进样口温度：250℃；载气：高纯氦。

1.3 质谱条件

电子轰击源：70eV；EI离子源温度：230℃；MS接口温度：280℃；测定模式为多反应监测离子扫描模式（MRM）。

1.4 数据处理

数据采集通过Agilent Mass Hunter Acquisition软件完成，数据处理利用Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis软件完成。

1.5 样品处理

准确吸取5.0mL样品置于50mL聚丙烯具塞离心管中，加入10mL乙腈，用液体混匀器在2500·r·min-1均质提取1min。加入2～3g氯化钠，再均质1min，将离心管放入离心机，在6000·r·min-1离心3min，取上清液5mL，在50℃下氮吹浓缩至近干，用一定体积比的正己烷丙酮混合溶液定容至1mL（如样品有杂质经0.2μm滤膜过滤），供气相色谱串联质谱测定。

2 结果与讨论

2.1 MLLE法提取条件的优化

传统的LLE法是在分液漏斗中进行，耗时费力，且成本较高。而本研究开发的MLLE法是在50mL离心管中进行，快捷方便，节约成本，利于环保，适用于液体样品的分析。农药残留常见的提取剂有乙腈、丙酮、正己烷和乙酸乙酯等。相同条件下采用不同溶剂提取进行比较，发现使用乙腈和丙酮提取效果最好。以毒死蜱为例，4种不同溶剂回收率分别为85.3%、80.6%、73.6%、和62.7%，但由于丙酮极性大溶解色素杂质比较多，基质干扰严重，而乙腈通用性强，对农药溶解度较大，可溶入的杂质量适中，因此选择乙腈作为提取溶剂，既保证了农残的提取效率又降低了基质干扰。不同提取溶剂对葡萄酒中有机磷农药提取效果的比较见图1。

图1 不同提取溶剂对葡萄酒中有机磷农药提取效果的比较Table 1 Extraction eficlency of pesticides in grape wine samples by different solvents

2.2 气相色谱-质谱条件的优化

在气相色谱串联质谱联用检测过程中，为了保证定性和定量的准确，必须对待测物的母离子和子离子、碰撞能量、扫描时间及监测反应离子的数目等一系列参数和质谱条件进行优化，以期达到最佳的检测效果。为优化出最佳的质谱条件，本实验在固定色谱条件下，通过优化碰撞能量（5～50ev）获得产物离子，最后采用多反应监测（MRM）模式，按保留时间分配采集时间进行扫描（MRM参数见表1），在保证每一种组分都具有良好峰形的前提下，达到了较高的灵敏度。在上述色谱条件下，得出混合标样的MRM谱图（见图2），在MRM模式下，对被测组分进行分离，敌敌畏、灭线磷、甲拌磷、甲基对硫磷、毒死蜱、倍硫磷、杀扑磷、三唑磷和伏杀硫磷9种农药均可较好地分离。

图2 9种农药混合标准溶液的多反应监测（MRM）图Figure 2 MRM chromatogram of standard solution of 9 pesticides standard solution

表1 9种有机磷农药的MRM参数Table 1 Mass spectrum parameters of 9 organophosphorous pesticides at MRM scan mode

2.3 标准曲线、线性范围及检出限

将标准溶液分别稀释成浓度0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00μg·mL-1，在本方法所确定的实验条件下进行测定，并绘制标准曲线，在上述浓度范围内，敌敌畏、灭线磷、甲拌磷、甲基对硫磷、毒死蜱、倍硫磷、杀扑磷、三唑磷和伏杀硫磷的浓度分别与其峰面积呈良好的线性关系。以3倍信噪比（S/N=3）计算得到9种有机磷的检出限均为0.005mg·L-1。以10倍信噪比（S/N=10）计算得到9种有机磷的定量限均为0.01 mg·L-1，结果见表2。

表2 9种有机磷农药的回收率和精密度（n=6）Table 2 Recovery and precision of 9 organophosphorous pesticides（n=6）

2.4 方法精密度和回收率的测定

在阴性葡萄酒的样品中分别添加3个浓度的添加水平，分别为0.02mg·L-1、0.10mg·L-1和0.20mg·L-1，对敌敌畏、灭线磷、甲拌磷、甲基对硫磷、毒死蜱、倍硫磷、杀扑磷、三唑磷和伏杀硫磷测定回收率，每个水平均平行处理测定6个样，计算平均回收率及精密度，结果见表2。经测定，平均回收率在70%～110%之间，相对标准偏差小于10%，本方法中农药组分测试结果处于可接受范围内，实现了葡萄酒中9种农药残留的快速定性与定量分析，采用MRM模式，对目标物不产生干扰，达到了较高的灵敏度，葡萄酒空白样品中添加有机磷农药的MRM图见图3。从图可知采用本法对葡萄酒的处理，可以很好的去除色素等杂杂质的干扰。

图3 葡萄酒空白样品中添加有机磷农药的MRM图Figure 3 MRM chromatogram of organophosphorous pesticides standards in blank grape wine amples

2.5 实际样品的测定

采用本文建立的方法对市场上的50份葡萄酒样品进行检测，在葡萄酒中检出甲基对硫磷和毒死蜱2种有机磷农残，有机磷农残含量在0.06～0.22mg·L-1之间，表明所购葡萄中含有有机磷残留且经发酵酿酒过程仍有部分农药残存于酒中。

3 结论

本研究采用微液液提取方法结合气相色谱串联质谱检测技术，建立葡萄酒中9种农残的检测方法。该方法前处理简单、快捷，缩短检测时间，减少有机溶剂的使用量，节能环保；采用气相色谱串联质谱技术减小基质干扰，化合物背景噪音更低，响应值较高，提高检测灵敏度，减少“假阳性”风险。检测低限可满足目前法规中对葡萄酒中各农药残留限量的要求。并对方法的线性范围、回收率、精密度、检测限等进行评价和验证，各项指标均符合《残留分析质量控制指南》要求。该方法灵敏、高效，可用于葡萄酒中多种有机磷农药残留的快速分析检测，并为其他葡萄酒检测技术的发展提供参考。