四种消毒剂对猪圆环Ⅱ型病毒核酸降解效果研究

李 博，李仁祥，黄荣珍，王贵平，刘自逵

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

1 前言

猪圆环病毒（PCV）是动物无囊膜病毒，最早在20 世纪90 年代初从患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪中分离到的[1-3]，可引起多种疾病感染[1-3]。PCV2 暴发和蔓延，给全球养殖业造成了重大经济损失。生物安全防控是养殖场防控传染病第一道防线。当前猪传染病防控形势依然复杂严峻，消毒在生物安全防控中具有不可替代的重要性。养殖场常用实时荧光定量PCR 检测病毒核酸[4]，以此来评估消毒效果。多种消毒剂都可以加速病毒核酸降解，但在养殖场实际生产应用中能否有效降解核酸并使之转阴，还需进一步研究。本试验模拟养殖场4 个生物安全防控场景，探究四种常见消毒剂对猪圆环Ⅱ型病毒核酸降解的差异性，为猪传染性疾病防控实践提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 病料样品

感染PCV2 患猪内脏和粪便来自于湖南省株洲市某规模化猪场。

2.1.2 试剂盒

病毒DNA/RNA 提取试剂盒（上海基灵生物科技有限公司；生产批号：NCE012，有效期：20230120）。猪圆环病毒Ⅱ型荧光PCR 核酸检测试剂盒（湖南冠牧生物科技有限公司，生产批号：2021004，有效期：20220713）。

2.1.3 消毒剂

进口过硫酸氢钾复合物粉(A）：推荐使用稀释浓度1:200, 朗盛化学（中国）有限公司；国产过硫酸氢钾复合物粉（B），推荐使用稀释浓度1:200，湖南加农正和生物技术有限公司，商品名:灭毒威甲；烧碱（C），推荐使用稀释浓度1:50，国药集团化学试剂有限公司；浓戊二醛（D），推荐使用稀释浓度1:50，湖南加农正和生物技术有限公司。

2.1.4 磷酸盐缓冲液: 准确称取磷酸氢二钠2.83 g和磷酸二氢钾1.36 g，加入蒸馏水1000 mL，待完全溶解后，调pH至7.2～7.4，于121℃灭菌20 min 备用。

2.1.5 戊二醛中和剂: 准确称量吐温-80 3 mL和甘氨酸1 g，溶于97 mL PBS 中，121℃高压灭菌20 min，4℃保存备用[5]。

2.1.6 过硫酸氢钾中和剂:准确称取硫代硫酸钠300 mg，溶于100 mL 磷酸盐缓冲液中，121℃高压灭菌20 min，4℃保存备用[6]。

2.1.7 2%烧碱溶液中和剂配制:等当量的盐酸。

2.1.8 试验时间和场地

2021 年12 月20 日～2022 年1 月6 日在湖南农业大学兽医微生物免疫实验室（室内）和实验楼外地面（室外）进行。试验前和试验后对场地进行消毒处理，生物安全措施均完备。

2.2 试验方法

2.2.1 病毒液制备

病毒液制备:取含有PCV2 患猪肾脏0.1 g 装入1.5 mL 离心管中，加入1 mL 生理盐水，充分研磨，反复冻融3 次。10000 r/min，离心5 min。取上清液用QPCR 验证，分装保存备用。

2.2.2 消毒剂配制

进口过硫酸氢钾复合物粉和国产过硫酸氢钾复合物粉均按照1:200 比例配制，戊二醛溶液按1:50 比例配制，烧碱按照1:50 比例配制。

2.2.3 场景模拟

（1）场景1：室外车辆轮胎粪便：将病毒原液用生理盐水稀释后与猪粪便混合，使混合后的PCV2核酸CT 值在33-36，制备成低病毒含量样品。将其涂抹到室外车辆轮胎四处部位。

（2）场景2：模拟室外露天地面粪便：将病毒原液用生理盐水稀释后与猪粪便混合，使混合后的PCV2 核酸CT值在33～36，制备成低病毒含量样品。将其涂抹到室外露天地面上，分别涂抹四处部位。

（3）场景3：模拟室内地面粪便：分别在4℃、25℃、37℃条件下，将病毒原液用生理盐水稀释后与猪粪便混合，使混合后的PCV2 核酸CT 值在33-36，制备成低病毒含量样品。将其涂抹到四个相同的搪瓷盘上。

（4）场景4：模拟猪场室内地面尿液中:在4℃、25℃、37℃条件下，分别取50 μL 稀释好的病毒液加入450 μL 消毒液，同时设置对照组，50 μL 稀释好的病毒液加入450 μL 生理盐水（病毒液与消毒剂比例为1:9）。本实验于2022 年1 月3 日～2022 年1 月6 日在湖南农业大学微生物免疫实验室进行。

2.2.4 消毒

场景1、2、3 中分别用100 mL 的消毒剂A、消毒剂B 和消毒剂D 泼洒。场景4 中用消毒剂A、消毒剂B、消毒剂C 和消毒剂D。同时设对照组，向对照组中泼洒等量生理盐水。分别反应0h（消毒前）、0.5h、1 h、3 h、5 h 和7 h 后取 样，进行QPCR 取样检测。

2.2.5 取样和检测方法

（1）取样：场景1、2、3 中用生理盐水浸湿的无菌棉签在每个时间点对消毒后样品采样，放到1.5 mL 离心管中，向离心管中加入100 μL 生理盐水和900 μL 中 和剂。震荡混匀，10000 r/min，离心1 min 后作为待测样品备用；场景4 中，从样品中抽取200 μL 作为待测样品。

（2）QPCR 检测：从待测样品中抽取200 μL，进行核酸提取，用实时荧光定量PCR 检测PCV2 核酸相对含量。

3 结果与分析

3.1 场景1 消毒效果评估

仔猪转群后地面粪便表面消毒效果评估见表1。该试验是在室外进行的，进行试验当天，气温2℃～7℃，试验期间一直有微小雨雾。室外车辆轮胎表面场景下，三种消毒剂对带毒固体表面消杀后，从表1 中可以看出PCV2 核酸转阴时间，消毒剂A（7h）、消毒剂B（7h）、消毒剂D（5 h）。在第7 h 三种消毒剂和对照组检测PCV2 的核酸均为阴性。戊二醛溶液在该场景中消毒较有优势。

表1 三种消毒剂对室外轮胎表面上PCV2 病毒核酸降解效果

3.2 场景2 消毒效果评估

室外露天地面粪便中PCV2 核酸降解试验结果见表2。试验当天，气温6℃～10℃，阴天。室外露天地面粪便场景中三种消毒剂对PCV2 消杀后，PCV2 核酸降解效果跟同时间点对照组的效果均差别不大。

表2 三种消毒剂对室外地面上PCV2 病毒核酸降解效果

3.3 场景3: 室内地面粪便中PCV2 核酸降解试验

（表3～表5）

表3 三种消毒剂4℃条件下对PCV2 病毒核酸降解效果(室内地面)

表5 三种消毒剂37℃条件下对PCV2 病毒核酸降解效果(室内地面)

不同温度下三种消毒剂对室内地面粪便中PCV2 消杀后，在不同时间点对PCV2 核酸进行取样检测。PCV2 核酸转阴分别为：消毒剂A（4℃，＞7h;25℃，5 h;37℃，＞7h）、消毒剂B（4℃，＞7h;25℃，7 h;37℃，＞7h）；消毒剂D（4℃，＞7 h;25℃，7 h;37℃，5 h）。

室内地面粪便场景中，在4℃条件下三种消毒剂在不同时间点对PCV2 核酸降解效果和对照组差别不大。室内地面粪便场景中，25℃条件下进口过硫酸氢钾复合物（A 消毒剂）5 h 能将PCV2 核酸降解为阴性。所以春秋季节推荐使用进口过硫酸氢钾复合物（A 消毒剂）对室内地面粪便消毒。37℃条件下，戊二醛溶液（D 消毒剂）在5 h 内可以将PCV2 核酸降解为阴性；进口过硫酸氢钾复合物粉和国产过硫酸氢钾复合物粉，对PCV2 核酸降解效果跟同时间点的对照组差别不大。所以夏季推荐使用戊二醛溶液对室内地面粪便消毒。

表4 三种消毒剂25℃条件下对PCV2 病毒核酸降解效果(室内地面)

3.4 场景4: 室内地面尿液中PCV2 核酸降解试验（表6 ～表8）

表6 四种消毒剂4℃条件下对PCV2 病毒核酸降解效果(地面尿液)

表8 四种消毒剂37℃条件下对PCV2 病毒核酸降解效果(地面尿液)

不同温度下四种消毒剂对室内地面尿液中PCV2 消杀后，在不同时间点检测PCV2 核酸。在消杀后，PCV2 核酸转阴时间：消毒剂A（4℃，＞7h;25℃，＞7 h;37℃，3 h）、消毒剂B （4℃，＞7 h;25℃，3 h；37℃，3 h）、消毒剂C（4℃，＞7 h;25℃，＞7 h;37℃，＞7 h）、消毒剂D（4℃，＞7 h;25℃，＞7 h;37℃，3 h）。

在4℃、25℃、37℃条件下，烧碱对PCV2 核酸降解效果与对照组没有明显差别。国产过硫酸氢钾复合物粉在25℃、37℃条件下均能将PCV2 核酸降解为阴性，戊二醛在37℃条件下均能将PCV2核酸降解为阴性。戊二醛对皮肤和呼吸道有刺激性，所以推荐使用国产过硫酸氢钾复合物粉消毒剂在该场景中使用。

表7 四种消毒剂25℃条件下对PCV2 病毒核酸降解效果(地面尿液)

4 结论

在场景1，室外带毒的车轮胎表面消毒中，戊二醛溶液对PCV2 核酸降解效果相对较好，推荐使用戊二醛溶液对室外带毒的车轮胎表面消毒。在场景2，室外露天地面粪便消毒中，推荐使用进口过硫酸氢钾复合物粉消毒。

在场景3，室内地面粪便消毒中，春秋季节，推荐使用进口过硫酸氢钾复合物对室内地面粪便消毒；夏季，推荐使用戊二醛溶液对室内地面粪便消毒。

在场景4，猪场室内地面尿液场景中，推荐使用进口过硫酸氢钾复合物粉消毒。

5 讨论

猪圆环病毒目前流行最广发病率较高的一种猪传染性疾病[7]，可以引起仔猪多系统衰竭综合征。PCV2 感染的患猪能引起免疫抑制，导致其他病毒和细菌的继发感染，给养猪行业造成了巨大的损失[8]。评估四种消毒剂PCV2 核酸降解的差异，可以给养殖场的生产实践提供有效临床依据，对建立完善消毒程序，指导科学生产，有效和合理使用消毒剂具有实际意义。

在室内地面尿液中PCV2 核酸降解试验中，烧碱溶液在7 小时内不能降解PCV2 核酸。烧碱溶液中的OH- 能够水解病原微生物的蛋白质外壳和核酸，使其变性，可以灭活病毒，OH- 对磷酸二酯键中的P 原子的攻击会引起环状2” ，3” 磷酸二酯中间体的形成。这种不稳定的中间体经过水解，得到2” 或3” 磷酸单酯。DNA 缺少2” OH- ，不能形成环状磷酸二酯中间体，并且磷酸二酯键也不能水解，故对碱有一定抗性。有相关研究结果表明，烧碱能有效灭活PRV 和ASFV 等病毒[9]。但本试验中烧碱溶液在7 小时内对PCV2 核酸均没有降解效果，其中的原因还需要进一步探索。

在猪场室内地面液体场景中，进口过硫酸氢钾复合物粉、国产过硫酸氢钾复合物粉、戊二醛溶液对PCV2 核酸降解效果会随着温度的升高而提高。有相关研究证明，0℃～40 ℃，戊二醛溶液的消杀效果随着温度的升高而增强[10]。过硫酸氢钾复合物粉使病原微生物蛋白质变性、改变细胞膜的通透性；干扰病原菌DNA 和RNA 的合成，从而杀死病原菌。有相关研究证明，过硫酸氢钾复合物粉能对病毒核酸有效降解[11]，与本试验结果基本一致。

进口过硫酸氢钾复合物粉、国产过硫酸氢钾复合物粉、戊二醛溶液消杀后，在患猪舍地面上带毒粪渣的场景中PCV2 转阴时间长于室内地面尿液中场景中 PCV2 转阴时间。可能是因为粪渣中有机物干扰作用，当病原微生物和有机物混合, 有机物阻止消毒剂与病原微生物直接接触，使消毒剂作用减弱。应该提高消毒剂浓度和延长消毒时间或者在对猪舍环境进行消毒前，应彻底去除圈舍内粪便、垫料等污染物，以免有机物影响消毒效果。

室外车辆轮胎粪便、室外露天地面粪便中场景中受到外界低温和粪渣中有机物因素的影响，进口过硫酸氢钾复合物粉、国产过硫酸氢钾复合物粉、戊二醛溶液对PCV2 核酸降解效果不理想。在室外条件下，温度、有机物、天气等因素都会影响消毒剂对PCV2 核酸降解效果。在实际生产过程中，建议选择消毒效果较强、受有机物影响小的消毒剂。