家畜布鲁氏菌病诊断方法与综合防控研究进展

姜子昕，兰邹然，邢林林，徐 聪，王建民，胡莉萍*，张 月*

（1.山东省动物疫病预防与控制中心/山东省人畜共患病流调监测中心，山东 济南 250100；2.山东新希望六和集团有限公司，山东 青岛）

布鲁氏菌病（Brucellosis，简称“布病”）是由布鲁氏菌引起的严重危害公共卫生的人畜共患传染性疾病，《中华人民共和国传染病防治法》规定其为乙类传染病。全世界有 170多个国家报道布病疫情的发生，在世界范围内广泛流行，并且布病易感动物高达 60余种，宿主范围广泛，极其不易清除。为了人类健康以及畜牧业的持续稳定发展，规范正确的诊断方法以及科学合理的防控措施是当前防控工作的重中之重。

1 实验室诊断方法研究进展

1.1 病原学诊断

1.1.1 细菌分离培养 布病诊断的金标准是细菌分离培养[1]，培养后的布鲁氏菌用科兹洛夫斯基染色法观察，可见散在呈串链状排布的红色球状小杆菌。值得注意的是布鲁氏菌的分离培养需要在生物安全三级（BSL-3）实验室进行，由于病原分离率较低且条件要求严格，操作复杂，耗时长，有较大的感染风险，在诊断过程中并不常用[2]。

1.1.2 分子生物学诊断 分子生物学诊断是对布鲁氏菌基因的深入研究，包括聚合酶链式反应技术（PCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）等。（1）PCR技术主要有普通 PCR、荧光定量 PCR以及多重PCR。普通PCR在1990年用于布病的定性检测[3]。多重PCR在同一体系中加入两对及以上的引物，可以快速鉴别布鲁氏菌种属。其中多重 AMOS PCR，因适用于“流产、羊种、绵羊、猪”物种而命名，可区分布鲁氏菌属物种以及疫苗和野生型菌株[4]。荧光定量PCR（qPCR）可对布鲁氏菌核酸进行定性定量分析，是目前最为精准的检测方法，但对实验设备以及人员技术有一定要求，成本较高，不适用于基层大批量检测。布鲁氏菌PCR技术采用的最常用目的基因包括IS711 插入序列、per 基因和bcsp31基因。临床应用主要针对保守的bcsp31基因，可避免由物种变化引起的假阴性结果[4]。董浩等对 3种序列qPCR检测方法进行比较，发现IS711 qPCR敏感性最高，可用于低核酸量样品的检测[5]。（2）LAMP可在恒温水浴条件下进行，根据颜色变化进行结果判定，不需要专业的仪器设备与实验条件，适合基层实验室的检测应用。Ohtsuki等[6]首次将LAMP应用于布氏杆菌的检测，该方法能检测到 10 fg DNA，具有良好的灵敏性。张萌等[7]将建立的 LAMP和 PCR 2种方法比较，在实际样品检测中发现具有同样的灵敏度和特异性。

1.2 血清学诊断

1.2.1 虎红平板凝集试验（RBT） 虎红平板凝集试验是一种抗原抗体体外结合的斑点凝集实验。该方法灵敏度较高，操作简单，但由于特异性和准确性较差，易出现假阳性或假阴性，所以只作为动物布鲁氏菌的初筛实验，对于所测阳性血清需试管凝集实验进一步确诊。

1.2.2 试管凝集试验（SAT） 试管凝集试验是布病的确诊实验之一，研究表明，通过用螯合剂如 EDTA处理血清可以增加试验特异性，减少由于IgM引起的交叉反应结果[4]。SAT需眼观判定，加入一种细胞染色染料有助于判断。李翠等[8]将SAT改进为微量试管凝集试验（MSAT），操作更为方便快捷，且抗原血清用量较少，相较于 SAT在实验室诊断中更为常用。

1.2.3 补体结合试验（CFT） 补体结合试验是OIE认可的确诊布病经典方法，同时也是国际贸易中牛、羊、绵羊种的指定实验。虽然该方法灵敏性与特异性在血清学检测中均较高，对于 RBT初筛阳性和SAT判定可疑的都可用CFT进一步确诊，但因为试验很难标准化，逐渐被ELISA取代。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫吸附试验分为间接 ELISA（iELISA）和竞争ELISA（cELISA）两类，iELISA作为布病的初筛实验，阳性及可疑血清通过 cELISA确诊。目前布病iELISA试剂盒多选用O链的光滑性脂多糖（LPS-S）作为抗原。近年来利用基因工程技术，以外膜蛋白 Omp10、Omp16、Omp31、Bp26等作为抗原建立方法，可以达到诊断粗糙型布鲁氏菌的目的。有研究表明，通过 OMP28蛋白抗体在体内不同时期的表达，可以区分布病的感染抗体和免疫抗体[9]。基于单克隆抗体的竞争 ELISA 也可以区别自然感染和 Rev. 1 疫苗接种产生的抗体[10]。孙天浩等将Dps铁蛋白作为布鲁氏菌诊断蛋白建立的iELISA，是对诊断靶标的进一步探索[11]。ELISA灵敏性和特异性均较高，但易与其他革兰氏阴性菌发生反应，例如耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157，一定程度影响试验特异性[12]。ELISA是OIE推荐并且国际贸易指定的牛种布病检测方法，但ELISA实验成本较高，步骤繁琐，需要耗费大量时间，适合实验室流调检测和布病筛查，不适用于快速诊断。

1.2.5 荧光偏振技术（FPA） 荧光偏振技术是利用分子大小不同的螺旋特性进行的同源性分析方法，常用牛种布氏杆菌 S1119. 3株的 O型脂多糖作为抗原，近年来，孙翠丽等提纯了猪种布鲁氏杆菌S2株OPS作为抗原，建立的方法经检验具有良好的特异性和敏感性[13]。任燕斌等对FPA、iELISA和cELISA进行比较，FPA最佳临界值95 mp时，特异性最高，达到100 %[14]。该方法是OIE指定的国际贸易中检测方法之一，欧洲和北美将其作为布鲁氏菌病根除检测方法，其特异性和敏感性较高，操作便捷用时短，适合在实验室进行应用。

1.2.6 琼脂扩散 琼脂扩散（琼扩）试验是一种可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中进行的沉淀反应。布鲁氏菌琼扩实验抗原包含脂多糖LPS与野毒株表面的多糖类半抗原（NH）。将抗原滴加在琼脂凝胶中央孔中，室温静置 24~48 h后，观察加入血清的样品孔与中央孔之间是否出现沉淀线。如果只出现LPS的沉淀线，则判断动物很可能只经过免疫，没有感染；如果出现两条沉淀线，则判断被检动物被野毒感染。琼脂扩散试验根据布鲁氏菌野毒株与疫苗株表面抗原的差异，可以检测区分动物是否被野毒感染[15]。该试验成本较高，操作较为复杂，敏感度有限，不适用于筛查监测以及实验室推广。

1.2.7 胶体金免疫层析技术（GICA） 胶体金免疫层析技术血清用量少，操作简单，适合基层临床检测。王海丽等[16]将 GICA应用到羊种布氏杆菌病的诊断，敏感性和特异性均大于95 %。李巧玲[17]将GICA与cELISA和RBPT 3种方法进行比较，GICA检测效果高于 RBT试验，与cELISA也具有较高符合率，适合作为快速的初筛方法。

2 布鲁氏菌病的防控措施

布病的防控关键在于做好生物安全管理措施，包括防控政策支持、动物疫情防控以及传染病的防控。（1）做到依法防控、科学防控。农业农村部于 2022年印发了《畜间布鲁氏菌病防控五年行动方案（2022-2026年）》，要求积极防御，系统治理。最大限度利用公共资源，使实施方案有保障。（2）做好动物疫情防控首先要及时开展流行病学调查，摸清底数，抓住布病的流行特征，针对最易突破环节采取措施。同时加强监测，采集样品主动进行监测，对发现的疫情进行统计学分析，发现和总结布病流行规律，进行预测预警。加强检疫的监督监管工作，外来的牛、羊、猪等易感动物要隔离检测后再入场。同时加强相关畜产品检疫，检疫合格后方可上市，对于布病患病畜禁止买卖。发生疫情时，按照“早快严小”原则，及时控制和扑灭疫情，将损失减小到最低[18]。（3）在养殖过程中，对于布病免疫区加大布病的疫苗接种工作实施力度，做到应免尽免。做好消毒工作，定期开展常规消毒，发生疫情时制定消毒规范进行紧急消毒。做好养殖场的粪污处理，防止环境污染以及布病的传播。各地进行动物划区管理，对各地家畜进行归档，有利于追根溯源。动物疫控部门定期开展风险评估工作，确定潜在风险，加强管理。对检测到的阳性病畜予以扑杀淘汰，及时按照处置规范进行无害化处理。加强宣传培训工作，提高群众对布病的防范观念，尤其是从业人员的生物安全意识，要提高工作人员素质，对从业人员定期培训，增强个人防护能力与意识。布病作为人畜共患病，要注意人病兽防，关口前移，兽医和卫生部门密切协作，建立多部门的联防联控机制，做到人畜同步。

3 小结

目前布鲁氏菌实验室诊断方法各有优缺点，虽灵敏度、特异性较高，却时常有假性结果的出现，需要两种以上方法联合使用，例如 RBT、iELISA适用于布病初筛，SAT、cELISA用于确诊试验。cELISA与琼扩等方法据报道能够区分野毒感染和疫苗免疫，但仍需进一步的开发研究。通过快速鉴别诊断方法及时监测，并结合科学合理的防控措施是目前布病防治的重点。