Nephrin在足细胞狭缝隔膜上的作用研究进展

吴慧敏综述 钟建审校

蛋白尿是肾脏疾病最重要的症状之一，其中大部分为肾小球性蛋白尿。肾小球性蛋白尿与肾小球滤过屏障的病理损伤有关，肾小球滤过屏障由3层组成：肾小球内皮细胞、肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)和肾小球内脏上皮细胞(足细胞)。过去20余年的研究表明，第三层足细胞是最后的屏障[1]。足细胞是GBM外层终末分化的上皮细胞，对于肾小球滤过屏障的完整性至关重要，它们是阻止蛋白质和大分子进入尿液的主要屏障。

1 狭缝隔膜的特征

狭缝隔膜(slit diaphragms，SD)是足细胞间一种特殊的细胞—细胞连接，与突触有共同的特点。足细胞的足突覆盖GBM的外侧，邻近足细胞的足突重叠呈交叉指状。在相邻的交叉指状足突之间形成的“滤过缝”是一个高度专门化的缝隙连接，称为狭缝隔膜，SD具有大小和电荷选择性滤过作用，所以滤过屏障的选择性滤过作用依赖于SD的完整性，它形成了蛋白质泄漏的主要尺寸屏障。早期的电子显微镜研究表明[2]，狭缝膜片呈现出拉链状的亚结构，交替周期性的跨桥从对侧足细胞质膜延伸出来，证明相邻足突是指间的。发育分析显示，毛细血管袢阶段出现SD，并逐渐取代紧密连接。Nephrin、NEPH1、P-cadherin、FAT和Ephrin-B1为形成狭缝隔膜分子筛的细胞外成分。其中，ZO-1、podocin、CD2AP、MAGI和Par复合物等胞质蛋白被鉴定为连接SD和细胞骨架的支架蛋白。SD不仅起到防止蛋白尿的过滤器作用，还起到复杂的信号中枢的作用，将不同的化学和机械刺激转移到足细胞。足细胞骨架失调或SD的完整性丧失可导致足细胞足突消失，这是足细胞疾病中最常见的病理学发现[3-4]。

2 Nephrin的特征

Nephrin是在研究先天性肾病综合征芬兰型时发现的，它是第一个被确定为SD细胞外成分的分子[5]，Nephrin 被认为是SD细胞外部分的主体。编码Nephrin的基因NPHS1由Kestila及其同事首次克隆。人类Nephrin被分配到染色体19，由19q13.1上的NPHS1基因编码，具有端粒到着丝粒的取向。NPHS1主要定位于肾小球，但在睾丸、中枢神经系统、胰腺、胎盘、心脏和淋巴组织中也有表达[6-7]。NPHS1基因大小为26 kb，共包含29个外显子，由1 241个残基的跨膜蛋白组成，含胞内区、跨膜区和胞外区3个功能域。胞内区含9个酪氨酸(tyrosine，Tyr) 残基，其中 Tyr1176、Tyr1193、Tyr1210具有被细胞内酪氨酸激酶 Src 磷酸化的潜力，与含 SH2、SH3 结构的结合蛋白的亲和力显著增加，参与多种细胞信号转导[8]。Nephrin有1个很长的细胞外结构域，由8个C2型IgG样结构域(Ig区)及 1 个Ⅲ型纤维蛋白区域组成。每个Ig区含 2 个半胱氨酸残基，可与Nephrin 分子或其他蛋白形成二硫键，与对侧足突的 Nephrin 分子或与其他SD蛋白发生嗜同性或异性结合，正是这些IgG—IgG界面形成了围绕肾小球毛细血管的拉链状SD网，形成了筛状结构[9]。

Nephrin是足细胞中维持SD正常结构的关键分子。Nephin与许多其他足细胞和SD蛋白相互作用，还介导足细胞中重要的细胞信号通路。Nephrin的缺失或氨基酸序列的改变[10-11]，会导致SD的破坏，进而产生大量尿蛋白。在许多成人发病的肾小球疾病中，Nephrin的表达发生改变[12-14]。一项关于诱导性Nephrin基因敲除的小鼠模型研究，观察到获得性长期Nephrin敲除影响肾小球足细胞、系膜细胞和基质、GBM和内皮细胞的所有成分，这表明Nephrin在基础条件下及在肾小球疾病中对肾小球功能至关重要[7]。这些研究表明，Nephrin是SD的关键功能分子，其功能障碍是人类肾小球疾病蛋白尿的常见致病机制之一。

3 Nephrin与SD上其他分子的联系

3.1 Nephrin与SD细胞外成分其他分子的联系

3.1.1 Nephrin与NEPH1: NEPH1是SD细胞外成分的另一个关键分子。通过基因捕获鉴定出NEPH1为Nephrin相关蛋白。它是一种跨膜蛋白，包含5个细胞外IgG结构域[15]。NEPH1敲除小鼠肾小球足细胞足突消失，产生蛋白尿，在大量足突消失和蛋白尿为特征的实验动物模型中，如原发性局灶性节段性肾小球硬化、微小病变肾病综合征及阿霉素肾病和嘌呤霉素氨基核苷肾病，NEPH1降低[16]，说明NEPH1对维持SD的屏障功能也是必不可少的。

NEPH1和Nephrin相互作用鉴于NEPH1和Nephrin的共定位和结构相似性。Nephrin的细胞质结构域直接与NEPH1的细胞质结构域相互作用，形成顺式异源寡聚体[17]。一项利用高分辨率超微结构的成像研究显示[18]，SD中可能的Nephrin和NEPH1成分的排列：单个NEPH1分子似乎以23 nm的宽度形成靠近肾小球基底膜连接的下部，而单个Nephrin分子以45 nm的宽度在更顶端形成相邻的连接。这些Nephrin和NEPH1复合物间隔7 nm，形成2层结构，将SD与其他类似Nephrin—Nephrin的细胞—细胞黏附模块区分开来。通过这些结构，结合Nephrin和NEPH1重复Ig折叠固有的灵活性，表明SD可能代表高度动态的细胞—细胞连接，在肾滤过装置内形成可调节的屏障。

3.1.2 Nephrin与Ephrin-B1：Ephrin-B1是Eph-Ephrin家族中的一种蛋白。Ephrin和Eph是作为受体—配体对发挥作用的膜结合蛋白。Ephrins分为2个亚类，B型Ephrins有1个跨膜结构域和1个包含4个酪氨酸残基的短细胞质区域，C端有1个PDZ结构域结合基序。Fukusumi等[19]研究表明，Ephrin-B1在SD上表达，Ephrin-B1参与维持SD分子的正确分子排列和SD的屏障功能。Ephrin-B1 细胞特异性条件敲除(cell specific conditional knockout，CKO)小鼠改变了SD成分的表达、足突消失并出现轻度但显著的蛋白尿，提示Ephrin-B1在维持SD的结构和屏障功能方面起着关键作用。

Ephrin-B1通过其胞外结构域与Nephrin结合，Ephrin-B1—Nephrin复合物在维持SD的结构和屏障功能方面起着至关重要的作用[20]。细胞外Nephrin刺激不仅使Nephrin磷酸化，而且使Nephrin结合的Ephrin-B1磷酸化[21]。这表明SD上的Ephrin-B1作为信号分子传递Nephrin检测到的信号。

3.2 Nephrin与SD细胞骨架连接的多种支架蛋白的联系

3.2.1 Nephrin与CD2AP：CD2AP是最初在T淋巴细胞分子CD2中发现的一种具有多个蛋白质—蛋白质相互作用结构域的细胞内蛋白[22]，包括3个Src同源3(Src homology 3，SH3)结构域和富含脯氨酸和盘绕的线圈区域，它与参与各种信号传导和囊泡转运过程的许多蛋白质相互作用，从而参与细胞骨架重塑的调节、胞质分裂、细胞凋亡和内吞作用。在肾小球中，CD2AP是一种80 kDa的SD相关支架蛋白[23]，CD2AP直接与肌动蛋白相互作用，表明CD2AP可能起到将膜蛋白(如Nephrin)连接到肌动蛋白细胞骨架的作用，从而稳定狭缝隔膜，被认为是SD复合物的“稳定剂”。缺乏CD2AP的小鼠出现足突缺失、严重蛋白尿及肾小球硬化等形态学改变[24]。

CD2AP可以通过其C末端结构域与Nephrin相互作用。CD2AP的N端结构域可以与p85结合，并促进Nephrin诱导的AKT信号传导，从而保护足细胞免于凋亡[25]。最近，Tossidou等[26]报道CD2AP是VEGF-A刺激的受体酪氨酸激酶的磷酸化靶点，并证明了CD2AP SH3-1结构域Y10位酪氨酸的磷酸化可以改变CD2AP对Nephrin的亲和力，对CD2AP的功能发挥是不可或缺的。并表明CD2AP和Nephrin之间存在一种精细调节的亲和平衡，这种平衡受受体酪氨酸激酶刺激的影响。

3.2.2 Nephrin与Podocin：Podocin(由NPHS2编码)仅在足细胞中表达，在SD复合体中作为支架蛋白。Podocin是一种完整的膜蛋白，其N端和C端结构域都指向胞浆。Podocin缺陷小鼠在产前或出生后5周内死亡[6]。电子显微镜显示足突与巨大系膜硬化融合，Nephrin表达显著降低。

Podocin通过其C末端结构域与位于质膜特定脂筏微结构域的Nephrin的细胞质部分结合，使其能够形成SD并执行其信号传递功能。Podocin可与Nephrin、NEPH1和CD2AP相互作用。

3.2.3 Nephrin与MAGI蛋白：MAGI蛋白(MAGI-1, MAGI-2, MAGI-3)属于膜相关鸟苷酸激酶蛋白(MAGUK)家族，具有分子支架功能，通过连接细胞表面受体和细胞骨架来协调信号复合物。MAGI-1与连接黏附分子4 (junctional adhesion molecule 4,JAM4)相互作用，共同提供了紧密连接的黏附机制，并且MAGI-1和JAM-4都在足细胞中表达[27]。免疫电镜显示，MAGI-1的定位局限于SD，而JAM4分布在SD和根尖膜上。

体外相互作用实验表明，MAGI-1通过中间PDZ结构域和Nephrin羧基末端结合[28]。据了解，MAGI-1在SD上与Nephrin和JAM4形成一个三部复合体。MAGI-2也在足细胞中表达，是在足细胞中表达的多域支架蛋白之一[29]。Shirata等[30]报道，MAGI2-CKO小鼠表现出SD破坏，足突形态异常和足细胞凋亡，导致足细胞丢失。Yamada等[31]最近的一项研究表明，MAGI-2通过PDZ结构域与其他支架蛋白一起协调Nephrin和NEPH1的定位。

3.2.4 Nephrin与Par-3/Par-6/ aPKC：在几种细胞类型中，Par-3/Par-6/ aPKC是调节细胞极性的核心。Par-3和aPKC在足细胞SD上表达，而NEPH1—Nephrin复合物与Par -复合物结合。

最近，Takamura等[20]证实，Par-3与Nephrin相互作用，而Par-6与SD上的另一种跨膜蛋白Ephrin-B1结合，Ephrin-B1通过胞外部分与Nephrin相互作用。使用显性阴性aPKC结构的小鼠显示出显著的蛋白尿，并且在使用aPKC抑制剂的隔离肾小球中检测到足突结构的缺失。这些观察清楚地表明，NEPH1—Nephrin—Par复合物对于维持SD的屏障功能是必不可少的。

3.2.5 Nephrin与NHERF2：Na+/H+交换调节因子2( Na+/H+exchanger regulatory factor 2，NHERF2)是NHERF蛋白质的一种亚型，最初通过使用Na+/H+交换器3(NHE3)的细胞质尾部进行双杂交筛选来鉴定[32]。NHERF蛋白质是将质膜蛋白与ezrin/radixin/moesin(ERM)家族成员连接起来的支架蛋白，从而将其与肌动蛋白细胞骨架连接起来。NHERF2的功能是调节其结合膜蛋白的表面表达[33]。

最近Fukusumi等[21]研究发现，NHERF2不仅在根尖膜上表达，而且在SD上也表达，NHERF2通过Ephrin-B1与Nephrin—Ephrin-B1复合物相互作用，Nephrin—Ephrin-B1—NHERF2复合物与ezrin相互作用。Nephrin—Ephrin-B1—NHERF2—ezrin—actin的连接是连接SD与肌动蛋白细胞骨架的关键连接之一，并且这种连接在维持交叉指状足突和SD方面起着重要作用。并发现刺激SD、Nephrin和Ephrin-B1的磷酸化可导致NHERF2和ezrin的去磷酸化，并破坏Nephrin—Ephrin-B1—NHERF2—ezrin—actin复合物。Ephrin-B1的磷酸化和随后的NHERF2的去磷酸化是导致蛋白尿和足突消失的关键起始事件。

4 Nephrin磷酸化在SD建立的信号平台

狭缝隔膜的作用不仅是一个屏障，也是一个信号平台，将信号传递到细胞内部。Nephrin是SD细胞外结构域的关键跨膜蛋白。Nephrin除了作为物理屏障的作用外，还在SD内发挥着中央信号平台的作用。Nephrin具有几个酪氨酸残基，这些酪氨酸通常相互独立协调信号传播，但有时也可以协同工作。将诱导信号通路的酪氨酸残基分为2组。A类酪氨酸包括Y1114(YEES)和Y1138/9(YYRS)，而B类酪氨酸是YDxV基序，包括Y1176 (YDEV)、Y1193 (YDEV)和Y1217 (YDQV)(人类编号系统)。Nephrin的酪氨酸残基可被Src家族激酶磷酸化，包括Src、Fyn、Lyn和Yes[34]。A类酪氨酸的磷酸化诱导与p85/PI3K的结合，最终导致Akt和Rac1的激活和Cofilin的招募，从而影响足细胞内肌动蛋白和局部黏附动力学[35]。B类酪氨酸磷酸化的影响是最广泛的。B类酪氨酸磷酸化导致Nck、PLC-γ1和ShcA的招募。Nck是一种含SH2/SH3的适配蛋白，Nck随后招募Pak和N-W ASp[8]，允许在Nephrin上聚合肌动蛋白。也有报道Nephrin在这个基团的酪氨酸残基处磷酸化，与另一个含有蛋白PLC-γ1的SH2/SH3相连[36]。至于Nephrin酪氨酸的磷酸化是否与足细胞损伤的促进或保护有关，目前尚缺乏共识，了解到磷酸化在基线、损伤和恢复中存在位点特异性差异。

酪氨酸磷酸化的Nephrin诱导2种形式的肌动蛋白结构[9]。一种形式是板状足，其中观察到二维肌动蛋白网格。板状足与足细胞的足突消失有关，并由第一组酪氨酸的磷酸化介导。另一种形式是肌动蛋白聚合物的生长(在Nephrin产生肌动蛋白尾)，这被认为与足突的稳定和SD结构的维持有关。肌动蛋白尾部的产生基本上是通过B类酪氨酸的磷酸化来介导的。B类酪氨酸磷酸化水平的降低在人类肾小球疾病中被检测到。最近的研究表明，与人类B类酪氨酸残基相对应的小鼠编号系统的3个酪氨酸残基Y1191、Y1208和Y1232在敲入小鼠后转化为苯丙氨酸，发生进行性蛋白尿并伴有结构变化[37]。结果表明，这些酪氨酸的磷酸化可稳定足细胞形态。

Nephrin酪氨酸的磷酸化受多种酪氨酸磷酸酶的负调控。在几种致病状态下也能检测到酪氨酸磷酸酶水平的改变。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP-1B)可直接去磷酸化B类的酪氨酸，在大鼠嘌呤霉素氨基核苷肾病(PAN)中上调[38]。含SH2结构域的磷酸酶1(phosphatase 1 of SH2 domain，SHP-1)在糖尿病肾病模型中升高，SHP-1可以使B类的酪氨酸脱磷酸化[39]。C1-Ten最近被鉴定为Nephrin酪氨酸磷酸酶，靶向A类酪氨酸(Y1114和Y1138)，在糖尿病肾病中也上调[40]。最近的一项研究表明[41]，Nephrin信号通路导致整合素β1的激活。这一发现提示Nephrin介导的信号调节足细胞附着在肾小球基底膜上。最近Martin等[42]的研究发现，足细胞损伤后，Nephrin磷酸化出现短暂上升，并与表面Nephrin减少相关，导致过滤屏障渗漏。揭示了足细胞损伤期间Nephrin酪氨酸磷酸化的瞬时变化、Nephrin定位和肾小球滤过屏障完整性之间的体内相关性。总之，Nephrin磷酸化决定了集群内效应蛋白的组成，以动态调节Nephrin周转和足细胞健康。

5 总 结

综上所述，足细胞是肾小球滤过最后的屏障，足细胞细胞骨架失调或SD的完整性丧失可导致足细胞足突消失，导致蛋白质泄漏。Nephrin是SD上重要的组成蛋白，它与SD上的其他组成蛋白在结构和功能上有着密切的联系，对维持SD的正常结构和功能发挥着关键性作用，Nephrin应该是蛋白尿新疗法最重要的靶点。Nephrin也在SD内发挥着中央信号平台的作用，Nephrin的磷酸化调控该区域的几个保守酪氨酸残基影响信号转导通路，信号通路的改变是足细胞损伤的重要途径之一。虽然Nephrin信号通路的病理意义尚不明确，但多项研究表明Nephrin各酪氨酸残基的磷酸化水平受到严格调控。Nephrin的磷酸化水平受PTP-1B和C1-Ten等磷酸酶活性的调控。这些磷酸酶可能成为蛋白尿新的治疗靶点。