分子蒸馏结合尿素包合法富集罗汉菜籽油中神经酸

李俊雯，朱明明，吴梦琪，周旭东，张文清

（华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237）

罗汉菜（Thlaspi arvense L.）为十字花科遏蓝菜属植物，学名菥蓂，别名遏蓝菜、败酱草、苦芥子、瓜子草等，分布广泛，因其莲座叶生长像叠罗汉而得名。罗汉菜全株和种子均可药用，全株具有清肝明目、和中解毒的功能，用于治疗目赤肿痛、消化不良、脘腹疼痛等病症，其种子还可治风湿性关节炎、腰痛、急性结膜炎、胃痛等病症[1]。研究表明，罗汉菜籽中富含亚油酸、亚麻酸、神经酸等脂肪酸，其中神经酸对中枢系统疾病、脑血管疾病都有积极作用[2]。但神经酸无法通过人体自身产生，需从外界摄取获得[3]。由于罗汉菜籽油中含有丰富的神经酸，可达到3.66%左右，因此可作为神经酸开发的原料[4]。

目前常见的分离混合脂肪酸的方法有，尿素包合法[5-6]，超临界 CO2萃取技术[7]，低温结晶法[8]、分子蒸馏法[9-10]等。尿素分子在结晶过程中能与直链脂肪酸分子形成六面体结晶体，饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸易于形成尿素包合物；高不饱和脂肪酸因不饱和度高，空间结构更复杂，不易形成尿素包合物。尿素包合法具有操作简便，试剂可回收等优点，被广泛应用于混合脂肪酸分离。分子蒸馏又叫短程蒸馏，是一种特殊的液-液分离技术，极高真空度下，依据混合物分子运动的平均自由程差别，在远低于其沸点的温度下将其分离。与普通真空蒸馏相比，分子蒸馏能避免热分解，精准精馏，减少了重要成分的损失。尿素包合法与分子蒸馏法联用被越来越多地应用于混合脂肪酸的纯化[11-12]。

本研究以罗汉菜籽为研究对象，以有机溶剂提取法提取油脂，皂化后得到混合脂肪酸。通过对分子蒸馏温度的单因素探究，确定最佳的分子蒸馏工艺。在此基础上，用正交试验探究尿素包合法的主要因素（尿脂比、料液比、包合温度）对神经酸含量和回收率的影响，分析分子蒸馏与尿素包合法联用对混合脂肪酸中神经酸富集的影响。研究旨在为神经酸生产利用提供理论依据与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗汉菜籽：上海市嘉定区农业技术推广服务中心，除杂、浮选去除品质较差的菜籽，干燥后粉碎，过40目筛，放入干燥器内备用；甲醇（分析纯）：上海阿拉丁试剂有限公司；尿素、氢氧化钠、乙醇、盐酸、乙酸乙酯、正庚烷（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；硫酸（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

旋转蒸发仪（R213B）：上海申生科技有限公司；油浴锅（DF-101S）：上海豫康科教仪器设备有限公司；冷冻干燥机（Scient2-10N）：宁波新芝生物科技股份公司；分析天平（ME104）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超纯水仪（Master-15）：上海和泰仪器有限公司；气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS，6890N-5975）：美国安捷伦有限公司；分子蒸馏装置（VKL70-5）：德国VTA公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸提取

以石油醚（60℃～90℃）为提取溶剂，将50 g罗汉菜籽加入到 400 mL 石油醚中[料液比为 1∶8（g/mL）]，加热回流75 min，提取2次，过滤后将溶剂回收（110℃常压蒸馏），得到油脂，出油率[13]按式（1）计算。

式中：m为混合脂肪酸质量，g；M为罗汉菜籽油脂质量，g。

1.3.2 脂肪酸组分分析

1.3.2.1 GC-MS条件

GC条件：HP-5MS型毛细管柱；载气为高纯氦气（99.999%），柱前压119.4kPa，柱内载气流量0.5mL/min；升温程序：从180℃开始，以3℃/min升温到280℃，汽化室温度为250℃；样品进样量为1μL；分流比为50∶1。

MS条件：采用EI离子源，离子源温度230℃，接口温度270℃，溶剂延时3 min，电子能量70 eV，扫描范围 30 amu～550 amu，分辨率 1 000。

1.3.2.2 配制样品溶液

在2 g油样中加入10 mL 2.5 mol/L的CH3ONa溶液，磁力搅拌并80℃加热回流至溶液澄清透明，再加入15 mL 0.5 mol/L的H2SO4甲醇溶液煮沸10 min。样品冷却后加入25 mL蒸馏水混匀，采用少量多次的方式，每次加入20 mL正庚烷萃取后得到正庚烷的脂肪酸甲酯溶液。最后去离子水洗涤样品至洗涤液呈中性，用无水硫酸钠干燥，滤液旋蒸浓缩后得到混合脂肪酸甲酯溶液，稀释100倍得供试液。

1.3.2.3 神经酸含量测定

标准曲线的绘制：精密称取0.102 3 g神经酸标准品，以甲醇为溶剂，配制浓度约为4 mg/mL的神经酸标准溶液。分别准确移取 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 神经酸

式中：γ为出油率，%；m为提取油质量，g；M为投入原料质量，g。

取100 g油脂于1 000 mL烧杯中，加入0.5 mol/L NaOH乙醇溶液800 mL，缓慢升温至80℃，水浴搅拌1 h。待温度降至室温（25℃）后加入适量蒸馏水至溶液澄清，加入20%盐酸调节pH值至2～3，转入分液漏斗，加入乙酸乙酯，充分振荡，静置分层，保留乙酸乙酯层。将乙酸乙酯层加水洗至中性，去除水层，再加入适量无水硫酸钠脱水，45℃旋蒸，回收乙酸乙酯，得到混合脂肪酸液，称重计算混合脂肪酸得率。标准溶液，进行甲酯化处理，0.45 μm有机滤膜过滤后再进行气相色谱检测。以神经酸质量（m）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行线性回归分析，绘制神经酸标准曲线。

1.3.3 分子蒸馏法最适温度的确定

称量250 g混合脂肪酸，在刮膜速度300 r/min、进料速度5%、蒸馏压力0.01 kPa、冷凝温度40℃的条件下，考察蒸馏温度从110℃～160℃对神经酸含量和重组分得率的影响。选择的两个温度作为一级蒸馏和二级蒸馏的蒸馏温度并收集二级蒸馏产物。

1.3.4 尿素包合法纯化神经酸的条件优化

称取分子蒸馏后所得混合脂肪酸1 g于三口烧瓶中，加入20 mL甲醇，并加入4 g尿素，80℃加热回流至尿素溶解。待溶液澄清透明后停止回流，冷却到室温（25℃）。采用正交试验的设置条件，混合脂肪酸在-20℃下包合12 h，从冷冻层取出，迅速抽滤，用少量蒸馏水溶解滤饼，加入20%盐酸调节pH值至2～3，通过石油醚少量多次萃取，并水洗石油醚层至中性，最后无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋蒸浓缩后得富集脂肪酸。以神经酸含量和回收率为指标探究尿脂比、料液比及包合温度对尿素包合法的影响，并验证其重复性。神经酸回收率按式（3）计算。

式中：m1为包合后混合脂肪酸中神经酸质量，g；m2为包合前混合脂肪酸中神经酸质量，g。

1.4 数据处理

每个试验重复3次，结果表示为平均值±标准差。采用GraphPad Prism 6.01软件进行作图，采用SPSS 19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸组分分析

气相色谱分析得到神经酸标准品甲酯的保留时间为26.23 min，神经酸标准曲线的回归方程为A=57.476m+7.239 9，相关系数R2=0.999 6，表明建立的神经酸含量标准曲线在2.046 mg～32.768 mg线性关系良好。

按1.3.1条件提取油脂，根据公式（1）计算出油率为22.38%，皂化后得到混合脂肪酸，根据公式（2）计算混合脂肪酸的得率为85.90%。罗汉菜籽油中的脂肪酸组成测定总离子流图如图1，各个脂肪酸的含量总结如表1。

图1 罗汉菜籽油脂肪酸甲酯总离子流色谱图Fig.1 The total ion chromatograms（TIC）of solvent extracted Thlaspi arvense Linn seed oils fatty acid methyl esters

表1 罗汉菜籽油中脂肪酸的种类及含量Table 1 The Composition and content of solvent extracted Thlaspi arvense Linn seeds oil fatty acids

由表1可知，罗汉菜籽油中主要有6种脂肪酸，含量最高的为芥酸，其次为亚麻酸和亚油酸，神经酸的含量达到6.40%。而神经酸在元宝枫油中含量为5.52%，在其余草本植物种籽油中含量＜3%[14-15]。罗汉菜籽油原料的神经酸含量还略高于已经市场化的元宝枫油原料，故将以此法所得的混合脂肪酸作为后续分子蒸馏-尿素包合法联用的原料。

2.2 分子蒸馏法纯化神经酸

按1.3.3中的条件，探究不同的蒸馏温度对神经酸含量和重组分得率的影响，结果如图2所示。

图2 不同温度下一级分子蒸馏对神经酸含量和重组分得率的影响Fig.2 Effects of first level molecular distillation at different temperature on content of nervonic acid and yield of heavy component

由图2可知，在110℃时分子蒸馏没有进行，原料全部进入了重组分，并没有达到分离的效果。110℃～140℃时神经酸含量随着温度的升高而升高，当140℃～160℃时随着温度的增加而下降，在140℃时神经酸含量达到最大值14.18%，而重组分得率一直随着温度的增加而减少，在120℃～130℃和150℃～160℃时迅速下降。综合神经酸含量和重组分得率考虑，140℃时两者都较高，为最佳的蒸馏条件，可以作为一级分子蒸馏的温度；而150℃与160℃相比，虽然神经酸含量的差距不大，但是重组分得率在160℃有较大下降，故选用150℃作为二级蒸馏条件。综上所述，选用140℃和150℃作为一级分子蒸馏和二级分子蒸馏的温度，进行二次分子蒸馏对神经酸进行富集。

二次蒸馏后混合脂肪酸GC-MS总离子流图如图3所示，结果如表2所示。

“有，有，有！”蒋老一边答应，一边跑进房里，在衣柜中乱翻一气，找出一件淡红色连衣裙。敲响卫生间的门，门开了，紫云不小心探出半个身子。蒋老一阵眩晕，顿时觉得地板在摇晃。顾不得那么多，紫云索性冲出来，一下把他抱住，要不，他非倒地不可。

图3 二次分子蒸馏前后脂肪酸甲酯总离子流色谱图对比Fig.3 The comparison of TIC of methyl esters of fatty acids by two-levels molecular distillation

表2 分子蒸馏后的脂肪酸种类和含量Table 2 The composition and content of fatty acids molecular distillation

对比表1和表2可知，经过二次分子蒸馏后，重组分中相对分子质量相对较小的组分大幅度减少，棕榈酸含量降低至0.06%；神经酸含量大幅度提高，从6.40%提高到了20.77%。

2.3 尿素包合法最佳工艺

以二次分子蒸馏的重组分作为尿素包合法的原料，探究尿脂比、料液比和包合温度三者的影响，进行正交试验。参考文献[11-13]中相关条件，根据正交试验设计表L9（33），正交试验因素水平设计如表3。以纯化后的神经酸含量为考察指标，探究最优试验方案，结果如表4所示。

表3 正交试验的因素水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

极差R的大小反映各因素对指标的影响程度，由表4可知，对于神经酸含量和回收率而言，极差均为RA＞RC＞RB，表明尿脂比对二者影响最大，其次是包合温度，料液比对二者的影响相对较小。在方案A3B3C2下，其回收率为70.66%，神经酸的含量为26.10%；而在方案A1B2C2下，回收率达96.45%，神经酸的含量为21.00%。方案A1B2C2虽然回收率很高，但是相比于原料中神经酸含量的20.77%，该工艺对神经酸几乎没有富集效果。方案A3B3C2的回收率虽然略低于方案A1B2C2，但神经酸含量提升较大，综合二者考虑，选择最佳条件为尿脂比 1.25∶1，料液比 1∶12（g/mL），包合温度-10 ℃。在最优方案的条件下平行做了3次验证试验，结果见表5。

表4 正交试验结果Table 4 The Results of orthogonal experiment

表5 验证试验结果Table 5 The Results of verification experiment

由表5可知，神经酸含量可达26.23%，回收率可达70.82%，结果说明通过尿素包合法可以对分子蒸馏后混合脂肪酸中的神经酸进一步富集。

3 结论

本文采用有机溶剂法从罗汉菜籽中提取粗油，出油率为22.38%，采用分子蒸馏-尿素包合联用的方法富集神经酸。分子蒸馏试验中考察了蒸馏温度对分离效果的影响，尿素包合试验中探究了尿脂比、料液比和包合温度对分离效果的影响。分子蒸馏能去除与神经酸相对分子质量差异较大的物质，而尿素包合法能去除饱和脂肪酸和一些低不饱和度的脂肪酸，两者结合能使原料中的各类物质更好地分离。通过分子蒸馏结合尿素包合法也将神经酸含量从6.40%提高至26.23%。本研究为罗汉菜的油脂工艺开发提供了可靠的技术支持，为提高罗汉菜的综合利用率提供了新思路。