不同拟杆菌的定殖对伪无菌小鼠血清生化指标和短链脂肪酸的影响

郑志天，程教擘，钟亚东，陈苏明，黄同文，孙永敢，胡婕伦

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，中加食品科学技术联合实验室（南昌），江西 南昌 330047）

肠道菌群是指所有寄居在人体肠道内的微生物群落，近年来的研究逐渐揭示了肠道菌群的结构组成以及肠道菌群失衡对宿主整体健康的影响[1-3]。在辅助宿主消化及营养吸收、维持肠道发育和预防疾病等方面肠道菌群起着至关重要的作用[4-8]，这促使人们探索针对肠道菌群的干预措施，其中选择性增加有益于人类健康的肠道微生物是一个新的研究热点。目前改善肠道菌群主要分为两个途径，一是直接通过进食或灌肠移殖的方式增加肠道益生菌，二是通过摄入不可消化的膳食纤维等益生元选择性刺激少数有益菌调节肠道菌群从而改善宿主健康[9-12]。肠道菌群数量庞大、种类丰富，与宿主的交互关系错综复杂。对具体肠道菌特性的研究，有助于达成肠道菌群干预措施效益最优化的目的。

肠道菌群主要由拟杆菌门和厚壁菌门组成，占肠道菌群总量的90%以上[13]。拟杆菌可赋予宿主多种益处，其中包括发酵宿主不易消化的多糖以提供能量。拟杆菌属是已知肠道菌群中多糖利用位点最多的一类菌，它们中约有20%基因组用于多种多糖的转运和分解以及这些过程的调控[14]，其能发酵难消化的大分子碳水化合物为宿主提供能量并转化为短链脂肪酸。短链脂肪酸在肠道内不仅可作为肠黏膜细胞的主要能量来源和营养物质，还可以减少促炎因子的生成，降低结肠炎症的发生，这直接影响了肠道微生物生态和整体肠道健康[15-16]。拟杆菌这种优势菌可通过自身的定殖直接抑制其他有害菌群的肠道黏附和生长，并且在宿主肠道菌群失调时重新引入该菌可以尽快促使肠道微生态恢复至平衡状态[17]。无菌小鼠是用于研究特定肠道微生物代谢及其与宿主相互作用的经典媒介[18]，然而其价格昂贵，难以普及以应对日益增加的肠道菌群相关研究。此外，无菌小鼠淋巴系统发育不成熟，在免疫等方面与常规小鼠差异较大[19-20]。通过灌胃广谱抗生素混合物剔除绝大多数肠道菌群的方法建立伪无菌小鼠动物模型，该模型小鼠生理变化与正常小鼠基本无显著性差异，且其研究结果往往与无菌小鼠动物模型保持一致[21-22]。因此，开发这种易获得、低成本、免疫系统发育更完善的无菌小鼠替代模型对于肠道菌群研究有着重要意义。本研究通过灌胃混合广谱抗生素建立伪无菌小鼠模型，将多种耐酸肠道拟杆菌分别定殖于伪无菌小鼠肠道中，构建简化的肠道菌群结构模型，使单一拟杆菌株成为小鼠体内的主要优势菌，以便观察其对小鼠健康及代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Bacteroides koreensis YS-aM39、Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827、Bacteroides ovatus JCM 5824、Bacteroides xylanisolvens XB1A、Bacteroides salyersiae JCM 12988、Bacteroides vulgatus ATCC 8482：由南昌大学中加食品科学技术联合实验室从健康人体粪便中筛选所得；盐酸万古霉素（美国药典级别）、硫酸新霉素（美国药典级别）、氨苄青霉素（纯度96%）、甲硝唑（纯度≥99%）：北京索莱宝科技有限公司；脑心浸液肉汤（brain heart infusion broth，BHI）固体培养基、BHI液体培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒、荧光定量预混试剂盒：天根生化科技有限公司；乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、2-乙基丁酸（纯度均≥99.5%，分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；实验室用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（XS205）、pH 计（FE28）：上海梅特勒-托利多仪器公司；台式高速冷冻离心机（Sorvall ST16R）、超微量分光光度计（NanoDrop2000）、实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）扩增仪（ABI 7900HT）：赛默飞世尔科技公司；PCR热循环仪（T100TM）：伯乐生命医学产品有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-100SII）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；比浊仪：上海德记行科技发展有限公司；厌氧手套箱（COY-8300600）：美国 COY公司；生物安全柜（BSC-1304IIA2）：苏州安泰空气技术有限公司；自动菌落成像分析系统（FLASH&GO）：西班牙IUL公司；气相色谱仪（7890B）：安捷伦科技（中国）有限公司；全自动生化分析仪（AU480）：贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司。

1.3 实验动物

BALB/c 5周龄小鼠[雄性，无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级小鼠，体重为（20±2）g，许可证号SCXK（京）2016-0006]、灭菌动物饲料、灭菌垫料：北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 菌株鉴定

实验所用拟杆菌均为健康人体粪便通过BHI拟杆菌选择性培养基筛选获得，为确保实验的准确性，在动物实验前对-80℃保存的拟杆菌进行菌株鉴定。

采用上游引物27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、下游引物 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[23]进行菌株全长16S rDNA序列PCR扩增，PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，将琼脂糖凝胶目的片段回收后对其16S rDNA进行全长测序。最后将拼接好的16S rDNA全长序列在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）生物大分子序列比对搜索工具（basic local alignment search tool，Blast）核酸数据库进行序列的同源性比较。

1.4.2 拟杆菌耐酸能力测定

用盐酸制备pH值为3.0的BHI液体培养基，采用比浊仪校正活化的接种菌液初始菌浓度，使其浓度达到0.5麦氏比浊标准，取100 μL菌液接种于5 mL培养基中，置于37℃厌氧培养箱，于0、4 h进行活菌平板计数，平行实验3次[24]。

1.4.3 混合抗生素诱导的伪无菌小鼠模型的建立

小鼠适应性饲养7d，按各组间平均体重无显著差异重新分组，每组小鼠共10只。为灭活SPF小鼠肠道菌群，每隔12h用万古霉素（50mg/kg）、新霉素（100mg/kg）和甲硝唑（100 mg/kg）的混合溶液对小鼠灌胃1次，灌胃体积10 mL/kg；并在饮用水中加入氨苄青霉素（1 mg/mL）[20，25]。持续干预 7 d，每天采集小鼠粪便并监测体重变化。

1.4.4 伪无菌小鼠模型有效性的检验

1.4.4.1 稀释涂布计数

将抗生素处理前和处理后小鼠粪便加入适量灭菌水均质成悬浮液，10倍等梯度稀释涂布于BHI固体培养基，厌氧手套箱37℃培养48 h，利用自动菌落成像分析系统平板计数，将小鼠粪便活菌总数检测限设定为1 CFU/mg定义为成功耗竭可培养肠道微生物[20]。

1.4.4.2 实时荧光定量聚合酶链式反应

由于大多数肠道微生物不可培养[26]，还需通过16S rDNA基因qPCR估算粪便中细菌DNA的含量。使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取抗生素处理前和处理后小鼠粪便中的DNA；按照Jimeno等[27]的方法进行qPCR质粒标准品的制作和获得标准品的循环数阀值（cycle threshold value，CT值），通过绘制标准品的CT值与质粒拷贝数的对数作图，生成标准曲线；按照实时荧光定量PCR试剂盒说明采用荧光染料法在ABI 7900HT扩增仪上得到粪便样品的CT值，通过标准曲线计算粪便样品的16S rDNA拷贝数。

1.4.5 菌株移植

挑选4株耐酸性较强的拟杆菌进行活化并富集，菌液6 000 r/min离心10 min后弃去上清液，再用少量灭菌生理盐水重悬进行浓缩，使菌液浓度达到109CFU/mL～1010CFU/mL，新鲜菌液灌胃给小鼠（10 mL/kg）。对照组灌胃灭菌生理盐水。

拟杆菌定殖组分为B.koreensis组（Bacteroides koreensis YS-aM39定殖组）、B.thetaiotaomicron组（Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827定殖组）、B.salyersiae组（Bacteroides salyersiae JCM 12988定殖组）、B.vulgatus组（Bacteroides vulgatus ATCC 8482定殖组）。抗生素处理一周后，开始进行拟杆菌定殖，每天灌胃1次，共5 d。收集灌胃5 d后的小鼠粪便，稀释涂布于BHI固体培养基上，37℃厌氧手套箱培养48 h，挑选形态一致且占平板绝大多数的菌落进行菌株鉴定，检验菌株是否定殖成功。

1.4.6 体重和脏器指数测定

小鼠每天称重，处死后取主要脏器（脾脏、肾脏、肝脏、心脏、胸腺）并用生理盐水清洗，滤纸吸干水分后称量并记录脏器质量，用于计算脏器指数。

脏器指数/（mg/g）=脏器质量（mg）/小鼠体重（g）

1.4.7 血清生化指标测定

小鼠取血后，放置0.5h凝血后离心（4℃，3000r/min，15 min），分离血清置于-80℃冰箱保存。取80 μL小鼠血清加入160 μL生理盐水进行稀释，利用全自动血清生化仪测定谷丙转氨酶、胆固醇、甘油三酯、谷草转氨酶、血清总蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血清白蛋白、尿酸、尿素、血糖含量。

1.4.8 盲肠内容物短链脂肪酸含量测定

称取100 mg左右的小鼠粪便加入0.6 mL饱和磷酸盐缓冲生理盐水（pH7.3）和1 mmol/L内标（2-乙基丁酸）20 μL 匀浆，4℃，14 000 r/min，15 min离心取上清液过膜（0.22 μm 水系滤头），取 200 μL上清液，加入0.1 mL 50%（体积分数）硫酸溶液，加400 μL乙醚，涡旋后静置2 min，取上清液测定[28]。根据短链脂肪酸（乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸）标准品的标准曲线计算出粪便中短链脂肪酸的含量。

1.5 数据处理

实验数据均采用OriginPro 2021统计软件进行分析处理，数据用平均值±标准差表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，事后多重比较采用Tukey法，P＜0.05为有显著差异；将对照组与拟杆菌定殖组、拟杆菌定殖组间的6种短链脂肪酸成分含量利用协方差矩阵标准化后进行主成分分析（principal components analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果

实验所分离得到的6株拟杆菌16S rDNA全长序列比对结果如表1所示。

表1 6株菌株16S rDNA序列比对结果Table 1 16S rDNA sequence alignment results of six Bacteroides

如表1所示，6种拟杆菌的16S rDNA全长序列在NCBI核酸数据库中比对后，序列覆盖度均为99%，序列同源性都在99%以上，可以认定为同一种菌。

2.2 6株拟杆菌耐酸能力

观察6株拟杆菌在pH3.0的环境下存活4 h的情况，结果如表2所示。

表2 6株拟杆菌在pH3.0处理条件下培养4 h的活菌存活率Table 2 Survival rate of viable bacteria of six species of Bacteroides cultured under pH3.0 treatment for 4 h

人体胃液中胃酸的主要成分为盐酸，其pH值通常为3.0左右，只有具有良好耐酸能力的菌群可以通过胃酸屏障，以活菌形式到达肠道并发挥作用。如表2所示，Bacteroides koreensis YS-aM39存活率最高，Bacteroides vulgatus ATCC 8482、Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827和Bacteroides salyersiae JCM 12988存活率次之，这4种菌在酸性条件下培养4 h活菌存活率仍维持在10%以上，说明这4种拟杆菌具有相对较好的耐酸能力；而Bacteroides xylanisolvens XB1A、Bacteroides ovatus JCM 5824存活率较低，其中Bacteroides ovatus JCM 5824存活率不足1%，说明该菌株的耐酸能力差。

综合考虑这6种拟杆菌的耐酸能力及各菌株的特性，将 Bacteroides koreensis YS-aM39、Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827、Bacteroides salyersiae JCM 12988和Bacteroides vulgatus ATCC 8482作为拟杆菌定殖菌株。

2.3 伪无菌小鼠粪便涂布计数及实时荧光定量PCR

2.3.1 涂布计数

抗生素处理前后小鼠粪便活菌计数如表3所示。

表3 抗生素处理前后小鼠粪便活菌计数Table 3 Count of viable bacteria in mice feces before and after antibiotic treatment

由表3可知，抗生素处理前小鼠粪便中可培养活菌总数为（4.09±1.38）×105CFU/mg，而抗生素处理 7 d后，粪便中活菌总数极显著性减少（P＜0.01），可培养活菌基本无检出，但还未符合粪便活菌总数检出限标准1 CFU/mg，实验结果能在一定程度上说明混合抗生素处理建立伪无菌小鼠模型是可行的。

2.3.2 粪便DNA实时荧光定量

抗生素处理前后小鼠粪便中菌群总16S rDNA拷贝数如表4所示。

由表4可知，抗生素处理前后小鼠粪便菌群总16S rDNA拷贝数极显著性减少（P＜0.01），下降了3个数量级，这相当于减少了粪便中99.9%以上的细菌，且与Olson等[25]所建立的伪无菌小鼠模型DNA含量仅降低400倍相比具有更好的效果。本实验结果更有力地证明了混合抗生素处理建立伪无菌小鼠模型的可行性。

表4 抗生素处理前后小鼠粪便中菌群总16S rDNA拷贝数Table 4 Total 16S rDNA copy number of mice feces microbiota before and after antibiotic treatment

2.4 菌株定殖结果

菌株移植后收集各组小鼠粪便稀释涂布于BHI培养基上，挑选形态一致且占平板绝大多数的菌落进行菌株鉴定，16S rDNA全长序列比对结果如表5所示。

表5 4株拟杆菌移植后小鼠粪便中主要菌种的序列比对结果Table 5 Sequence alignment results of main bacterial species in mice feces after transplantation of four Bacteroides

一般认为16S rDNA序列同源性大于99%的定义为同种细菌，同源性介于95%～99%的界定为同属的细菌[29]。如表5所示可知，B.thetaiotaomicron组和B.vulgatus组小鼠粪便主要菌株鉴定结果与其所移植菌Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827和Bacteroides vulgatus ATCC 8482序列覆盖度达到100%，而且序列同源性也大于99%，实验结果有力地证明了B.thetaiotaomicron组和B.vulgatus组菌株在小鼠体内成功定殖。B.koreensis组序列覆盖度为100%，序列同源性为96.53%（＜99%）；B.salyersiae组则是序列覆盖度94%（＜98%）和序列同源性 95.22%（＜99%）都较低，说明B.koreensis组和B.salyersiae组灌胃活菌未能成为小鼠肠道中的优势菌，菌株定殖结果相对较差。

2.5 4种拟杆菌的定殖对小鼠体重及脏器指数的影响

2.5.1 体重变化

4种拟杆菌的定殖对小鼠体重变化的影响如图1所示。

图1 4种拟杆菌的定殖对小鼠体重变化的影响Fig.1 The effect of colonization of four kinds of Bacteroides on the weight change of mice

第1天至第7天为抗生素处理，第8天至第12天为菌种移植，第13天至第21天为观察期。如图1所示，抗生素处理期间小鼠体重迅速下降，灌胃菌液之后体重下降速度减缓或维持稳定，第11天后体重则开始回升，逐渐恢复至正常的状态。小鼠体重下降可能的原因一是抗生素处理的副作用，二是肠道菌的大量减少，缺少肠道菌群的辅助消化，肠道蠕动减缓，能量吸收减少。在解剖抗生素处理小鼠时发现其盲肠较正常小鼠显著变大且盲肠内容物多呈液态，与无菌小鼠具有相似的特征[30]。对照组和拟杆菌定殖组体重变化趋势基本相同，原因可能是在停止抗生素处理后，即使对照组没有进行菌种移植，但是SPF级动物房的清洁程度与无菌级有较大差距，在实验操作中被外部环境所污染，肠道中有其它菌落的定殖。

2.5.2 脏器指数

4种拟杆菌对小鼠主要脏器指数的影响如表6所示。

表6 4种拟杆菌对小鼠主要脏器指数的影响Table 6 Effects of four Bacteroides on the main organ indexes of mice mg/g

如表6所示，除了肝脏指数拟杆菌定殖组B.salyersiae与对照组具有显著性差异（P＜0.05）外，其他各组之间肝脏指数、心脏指数、肾脏指数、胸腺指数和脾脏指数均无显著性差异（P＞0.05），说明不同拟杆菌的定殖对主要脏器无显著性影响。

2.6 4种拟杆菌的定殖对小鼠血清生化指标的影响

4种拟杆菌定殖对小鼠血清生化指标的影响如表7所示。

表7 4种拟杆菌定殖对小鼠血清生化指标的影响Table 7 Effects of four Bacteroides colonization on serum biochemical indexes in mice

动物的血清生化指标，在一定程度上可以反映机体的整体代谢状况，从生化指标的异常变化可以推断出某一组织或器官的功能状况发生了改变。由表7可知，各组胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、血糖含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性无显著差异（P＞0.05），与对照组、B.koreensis组相比，B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus组小鼠血清总蛋白含量显著升高（P＜0.05）；与对照组、B.koreensis组相比，B.salyersiae、B.vulgatus组小鼠血清白蛋白含量显著升高；与B.koreensis组相比，B.salyersiae、B.vulgatus组小鼠血清低密度脂蛋白含量显著升高（P＜0.05）。此外，B.salyersiae组尿酸含量显著低于B.vulgatus组，尿素含量显著高于 B.thetaiotaomicron组（P＜0.05）。

对照组和拟杆菌定殖组B.koreensis较其它拟杆菌定殖组血清总蛋白和血清白蛋白含量稍低，血清总蛋白和白蛋白检测是反映营养状况和肝脏功能的关键指标[31-33]。对照组出现该情况的原因可能是与肠道菌群的缺失致使小鼠营养吸收障碍和肝脏疾病等有关[34-36]，而B.koreensis组出现此情况表明B.koreensis组所定殖的Bacteroides koreensis YS-aM39对小鼠营养吸收和肝脏功能改善作用有限；有研究发现无菌小鼠的尿酸水平显著高于正常小鼠与菌群移植小鼠[37]。高尿酸水平与痛风高度关联。B.salyersiae组尿酸含量低于其他实验组说明Bacteroides salyersiae ATCC 8482的定殖可能对高尿酸人群具有一定的积极作用。

2.7 4种拟杆菌的定殖对小鼠盲肠内容物短链脂肪酸含量的影响

4种拟杆菌的定殖对小鼠盲肠内容物短链脂肪酸含量的影响如图2所示。

如图2所示，对照组的乙酸含量显著高于B.koreensis、B.thetaiotaomicron 组（P＜0.01）；而丁酸含量显著低于 B.koreensis、B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus组（P＜0.05）；异丁酸、戊酸含量显著性地低于 B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus（P＜0.05）；异戊酸含量显著低于B.thetaiotaomicron、B.salyersiae组（P＜0.05）。在拟杆菌定殖组 B.koreensis、B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus 中 ，B.salyersiae、B.vulgatus组的乙酸、丙酸和戊酸含量显著高于B.koreensis组（P＜0.05）；B.thetaiotaomicron 组乙酸、异丁酸、戊酸和异戊酸含量显著性高于B.koreensis组（P＜0.05）。

图2 4种拟杆菌的定殖对小鼠盲肠内容物短链脂肪酸含量的影响Fig.2 Effects of colonization of four kinds of Bacteroides on the content of short-chain fatty acids in the cecum of mice

对拟杆菌定殖组和对照组、拟杆菌定殖组间的6个短链脂肪酸成分含量进行主成分分析，结果如图3所示。

图3a和图3b主成分累计方差解释率分别为76.4%、74.8%，说明提取出来的两个因子能够较好地反映原数据的信息。从图3a可以看出拟杆菌定殖组和对照组相比，具有较高的丁酸含量和较低的乙酸含量；而从图3b可以看出，B.koreensis组与B.thetaiotaomicron、B.salyersiae、B.vulgatus组相比，具有较低的乙酸、丙酸和戊酸含量，但是差异较小。短链脂肪酸在维持肠道黏膜功能和完整性中发挥重要作用，尤其丁酸是结肠上皮细胞的重要能量底物，拟杆菌定殖组丁酸均显著高于对照组，实验结果说明拟杆菌的定殖对维持小鼠肠道健康具有积极的作用。

图3 6种短链脂肪酸成分含量主成分分析Fig.3 Principal component analysis of six kinds of short-chain fatty acids

3 结论

本研究基于各种肠道菌的特性不同，利用混合抗生素处理建立伪无菌小鼠模型探讨不同人源肠道拟杆菌对小鼠的干预作用。结果表明，利用高浓度的混合抗生素处理能杀死小鼠肠道99%的细菌；通过灌胃Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827和Bacteroides vulgatus ATCC 8482能较好地定殖肠道；不同拟杆菌的定殖对伪无菌小鼠的脏器指数无显著影响；与其他拟杆菌定殖组相比Bacteroides salyersiae ATCC 8482定殖组血清中尿酸含量更低；与模型组相比，拟杆菌的定殖显著性地增加了小鼠血清总蛋白、血清白蛋白和丁酸的含量，而较低的血清总蛋白、血清白蛋白含量与营养吸收障碍有关，丁酸则在维持黏膜功能和完整性中发挥重要作用，研究结果说明拟杆菌的定殖可能对改善菌群失调小鼠的营养吸收和维持其肠道健康有积极的作用。

选择性增加有益于人类健康的肠道微生物是一类新兴的健康干预措施，但由于肠道菌群种类丰富、与人体交互关系复杂，均要求研究人员对具体的肠道菌有透彻地了解，这样才能在肠道菌群干预措施中获得最佳效益，本研究结果可以为此提供一定的数据和理论支持。