缺氧诱导因子-1α低表达对肺癌A549细胞增殖及侵袭能力的影响研究

郭 亮，贾明选，商玉立

(1.河南科技大学附属黄河三门峡医院心胸外科，河南 三门峡 472000；2.河南省胸科医院呼吸内科，河南 郑州 450000)

肺癌是目前发病率及病死率增长最快的恶性肿瘤[1]，其主要治疗方式是手术切除与术后放化疗结合，但对于中晚期患者并不适用，且大部分经根治性切除术治疗的患者5年复发率仍>30%[2]。研究显示，侵袭及转移是肺癌的特征及恶性标志，也是导致患者死亡的主要原因[3]。因此，深入研究肺癌发病机制，探寻侵袭对应靶点，是提升肺癌疗效的新方向。低氧微环境是肺癌发展过程中必然经历的环境之一，肺癌细胞通过激活一系列信号通路调控对应基因表达，在适应低氧的同时自身增殖、侵袭能力也得以增强，在该过程中缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)具有中枢纽带作用[4]。HIF-1α属异源二聚体DNA结合蛋白，在缺氧时可激活多种应激蛋白表达，参与缺氧应激、血管生成、细胞行为等调控过程，通常被认为是机体自我保护的启动因子与共同途径[5]。目前已有研究证实HIF-1α异常高表达于肝癌、口腔癌等恶性肿瘤中，且参与细胞增殖、侵袭等的调控，但关于其在肺癌细胞中的表达及作用研究尚少[6，7]。本研究于2020年1～6月通过建立低表达及过表达HIF-1α的肺癌A549细胞株，研究其对该细胞系增殖及侵袭的影响，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞系 人肺癌A549细胞株，购自武汉原生原代生物医药科技有限公司，培养于RPMI 1640培养基中(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素)，培养条件为37 ℃、5% CO2。

1.1.2药物、主要试剂和仪器 携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体HIF-1α低表达质粒(HIF-1α-siRNA)、HIF-1α过表达质粒(HIF-1α-pLentiGFP)、对照质粒pLentiGFP(上海吉玛制药技术有限公司)，LipofectamineTM3000试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，Trizol试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)SYBR II试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)，兔抗人HIF-1α、趋化因子受体(Cys-X-Cys receptor 4，CXCR4)、上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)一抗，山羊抗兔IgG二抗(美国abcam公司)，二甲基噻唑(MTT)溶液、二甲基亚砜(DMSO)溶液(美国APExBIO公司)。StepOne Puls qRT-PCR仪(美国ABI公司)，680酶标仪(美国Bio-Rad公司)，Transwell小室(上海夏夷实业有限公司)，Synergy-HD显微镜(日本Toshiba公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞缺氧处理 取A549细胞传代培养，细胞铺满瓶底80%左右时，转移至5% CO2、1% O2、94% N2缺氧培养箱中缺氧培养，用于模拟肿瘤内部低氧微环境，设置为缺氧处理组，取正常培养的A549细胞设为正常组。

1.2.2qRT-PCR、Western blot检测HIF-1α表达 取正常组、缺氧处理组细胞。PBS洗涤，Trizol试剂盒提取总RNA，经浓度及纯度测定后反转录得cDNA，定量后根据qRT-PCR SYBR Green试剂盒说明书进行反应体系的设定：SYBR Premix Ex Taq II 11.5 μl，10.0 μmol/L上、下游引物各1.0 μl，DNA模板2.5 μl，加入dd H2O至总体积25.0 μl。反应条件：93 ℃预变性6 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，42个循环。以GAPDH为内参基因，2-△△CT为目的基因相对表达强度，实验所用引物：HIF-1α：上游引物：5’-CGTACGTGCACGCTACGTGCACGC-3’；下游引物：5’-CGTAGCGGTGCCGCATGCCGTGAC-3’；GAPDH：上游引物：5’-TGACGCGCTGCACGCTACGTGCAC-3’；下游引物：5’-GTGCAGCAGCTGCACGCTGCACGC-3’。

取正常组、缺氧处理组细胞。PBS洗涤，RIPA裂解液冰上裂解，BCA试剂盒定量、配平蛋白。取50 μg样本与等体积SDS-PAGE laoding buffer混合，100 ℃煮5 min。10 000 r/min离心半径8 cm离心15 min，取上清，恒定电压下电泳，湿转至PVDF膜持续2 h，摇床清洗10 min，5%脱脂牛奶常温孵育1 h。加入1∶1 000兔抗人HIF-1α一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗涤，加入1∶8 000山羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，TBST洗涤，暗室中曝光、显影，凝胶成像系统分析灰度值，以HIF-1α条带灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白相对表达量。

1.2.3细胞转染 取缺氧处理对数期A549细胞，PBS洗涤，调整细胞密度至1×105个/毫升，重新接种至6孔板，待细胞再次融合至70%左右，根据LipofectamineTM3000试剂盒说明书设计实验步骤，将HIF-1α-siRNA、HIF-1α-pLentiGFP、对照质粒pLentiGFP转染至A549细胞，分别设为低表达组、高表达组、对照组，取不作处理的细胞设为空白组。每组设置5个复孔。荧光显微镜下观察转染效率。发出明亮的绿色荧光者为阳性细胞，转染效率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。转染48 h后取稳定转染细胞用于后续实验。

1.2.4qRT-PCR、Western blot检测HIF-1α表达 取空白组、对照组、低表达组、高表达组细胞。操作同1.2.2，检测HIF-1α mRNA、蛋白相对表达量。

1.2.5MTT实验检测增殖能力 取空白组、对照组、低表达组、高表达组细胞。PBS洗涤，调整细胞密度至1×105个/ml，重新接种至6孔板，分别于孵育24、48、72 h时，加入新制备MTT溶液(0.5%，20 μl/孔)，静置4 h，弃培养基，PBS洗涤后，加入DMSO溶液(150 μl/孔)，震荡15 min使结晶充分溶解，静置2 h，取上清，酶标仪测定490 nm波长处吸光度A值。重复3次取平均值。

1.2.6Transwell小室实验检测侵袭能力 取空白组、对照组、低表达组、高表达组细胞。PBS稀释Matrigel胶至1 mg/ml，预先铺设于Transwell小室(50 μl/孔)，各组细胞按照5.0×105个/ml接种于上室，下室加入500 μl RPMI培养基(含10%胎牛血清)，常规培养至Matrigel被完全降解，取出杯底滤膜，PBS洗涤，0.25%戊二醛固定20 min，0.1%结晶紫染色30 min，无菌棉签擦去上层细胞，洗涤、晾干后显微镜下观察，随机选取5个视野，计算穿膜细胞数/视野。重复3次取平均值。

1.2.7Western blot检测CXCR4、E-cadherin蛋白表达 取空白组、对照组、低表达组、高表达组细胞。同1.2.2洗涤、裂解、定量、变性、电泳、转膜、孵育。加入1∶1000兔抗人CXCR4、E-cadherin一抗，加入1∶8000山羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，TBST洗涤，暗室中曝光、显影，凝胶成像系统分析灰度值，以CXCR4、E-cadherin条带灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法应用SPSS 24.0统计学软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析检验多样本计量资料，若Levene检验方差齐，采用单因素方差分析进行总均值比较，然后LSD-t行两两比较，若Levene检验方差不齐，采用welch检验进行总体均值比较，采用Dunnett T3检验进行两两比较。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常组、缺氧处理组HIF-1α表达缺氧处理组HIF-1α mRNA、蛋白相对表达量高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组HIF-1α mRNA、蛋白表达(n=5)

图1 Western blot检测各组HIF-1α蛋白表达

2.2 转染效率观察荧光显微镜观察结果显示，对照组、低表达组、高表达组转染效率均>75%，可用于后续实验。见图2。

2.3 转染后各组HIF-1α表达情况空白组、对照组HIF-1α mRNA、蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组、对照组比较，低表达组HIF-1α mRNA、蛋白相对表达量降低，高表达组升高(P<0.05)；见表2、图3。

2.4 各组增殖能力比较空白组、对照组24、48、72 h MTT实验A值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组、对照组比较，低表达组24、48、72 h MTT实验A值降低，高表达组升高(P<0.05)。见表3。

图2 荧光显微镜下观察转染效率(×200)

表2 转染后各组HIF-1α mRNA、蛋白表达比较(n=5)

图3 Western blot检测各组HIF-1α蛋白表达

表3 各组不同时间点MTT实验A值比较(n=5)

2.5 各组侵袭能力比较空白组、对照组、低表达组、高表达组穿膜细胞数/视野分别(72.40±9.26)、(73.00±10.12)、(31.20±4.91)、(185.60±20.10)个，组间比较，差异有统计学意义(F=142.731，P<0.001)；与空白组、对照组比较，低表达组穿膜细胞数/视野减少(t=8.790；t=8.310，P<0.001)，高表达组增加(t=11.438；t=11.188，P<0.001)；空白组、对照组穿膜细胞数/视野比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

2.6 各组CXCR4、E-cadherin蛋白相对表达量比较CXCR4、E-cadherin蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与空白组、对照组比较，低表达组CXCR4蛋白相对表达量降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白相对表达量升高(P<0.05)，高表达组CXCR4蛋白相对表达量升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白相对表达量降低(P<0.05)；空白组、对照组CXCR4、E-cadherin蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图5。

图4 Transwell小室实验穿膜细胞数 a.空白组；b.对照组；c.低表达组；d.高表达组(×400)

表4 各组CXCR4、E-cadherin蛋白相对表达量比较(n=5)

图5 Western blot检测各组CXCR4、E-cadherin蛋白表达

3 讨论

肺癌的发生是多时间点且多变化性的进展过程，研究显示其是由多个个性化基因或基因组驱动的肿瘤疾病，抑癌基因通路失活、促癌基因通路激活贯穿于肺癌整个进展过程[8]。随着新型肿瘤生物标志物及靶向药物在临床中的应用，肺癌治疗效果得以提升，但进一步探寻新的治疗靶点，并开发对应药物改善其预后仍是当务之急。多数实体肿瘤如肺癌中均存在明显的低氧区域，而肿瘤细胞在低氧微环境中仍可持续增殖并发生侵袭、转移，HIF-1α发挥关键性作用[9，10]。本研究发现，肺癌细胞经低氧处理后，HIF-1α表达明显升高，暗示其有作为分子靶点用于肺癌治疗的潜能。

增生失控是恶性肿瘤主要的生长特征之一，而肿瘤组织增生过快将导致局部组织严重缺氧及代谢紊乱。HIF-1α是细胞在缺氧环境下进行适应性调节的关键性因子，在调节肿瘤细胞代谢、血管新生、增殖、侵袭、放化疗耐受中具有重要作用。目前乳腺癌、肾癌、食管鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤中均发现HIF-1α高表达，且其水平可显著影响预后效果[11～13]。朱月琴等[14]认为，HIF-1α与胃癌进程关系密切，且与TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移等有关。Wang等[15]发现，非小细胞肺癌中HIF-1α被激活后，可诱导细胞生长及血管生成，促进上皮间质转化过程。本研究结果中，与空白组、对照组比较，低表达组24、48、72 h MTT实验A值降低，穿膜细胞数/视野减少，高表达组均表现为相反趋势，提示HIF-1α低表达可抑制肺癌细胞增殖及侵袭，高表达则起到促进增殖及侵袭的作用。

CXCR4属7次跨膜G蛋白偶联受体家族成员，是普遍存在于肿瘤细胞中的趋化因子受体，其作为HIF-1α下游效应基因之一，在肿瘤低氧环境中可被激活，且与肿瘤细胞增殖、侵袭能力具有相关性[16]。Tan等[17]开展的体内异种移植实验表明，CXCR4通过介导间充质干细胞分化为癌相关成纤维细胞，促进结直肠癌细胞生长及转移，在肿瘤微环境转化中起着至关重要的作用。Guo等[18]研究显示，采用药物干预下调CXCR4表达，可显著抑制人肝癌细胞的迁移和侵袭能力。恶性肿瘤细胞突破基底膜发生侵袭、转移的过程复杂，上皮细胞失去极性，与周围细胞及基质的黏附率降低，细胞黏附力降低，侵袭及运动能力增强。E-cadherin是重要的细胞间黏附分子，与肿瘤黏附能力关系密切。本研究结果显示，与空白组、对照组比较，低表达组CXCR4蛋白相对表达量降低，E-cadherin蛋白相对表达量升高，高表达组则表现为相反趋势，提示HIF-1α低表达对肺癌细胞增殖、侵袭能力的影响可能通过调节CXCR4、E-cadherin蛋白表达实现。

综上所述，HIF-1α低表达可降低肺癌A549细胞增殖及侵袭能力，推测其作用机制与下调CXCR4，上调E-cadherin蛋白表达有关。