硫化钠对大鼠经口给药的毒性和致畸性检测

夏祺悦，岳茜岚，豆捷雄，庄思琪，刘科亮*

(四川省疾病预防控制中心，四川 成都 610041)

硫化钠是一种吸湿性很强的物质，通常我们观察到的是水合物而不是脱水形式。以现代工艺纯化制得的五水合硫化钠结晶粉末为正交晶型，能在干燥器内长期稳定存在。

硫化钠在工业领域常用作硫化染料、脱毛剂[1]、蒸煮剂，也是高能量密度的热化学材料，能改善环境重金属污染[2]。硫化钠在医药领域也发挥着积极的作用[3]，它是一些口服药制备工艺中的催化剂，可以制备肌肉松弛药氯唑沙宗中间体2氨基4氯苯酚[4]，也用于制备抗感染药物硝呋太尔[5]等。文献报道口服硫化钠肠溶片和肠溶胶囊可用于多项疾病的治疗及辅助治疗[6]。在传统味精制作工艺中，一般采用硫化钠作为除铁剂。由于硫化钠具有经口暴露的可能性，我们应对其经口毒性引起重视。

目前已有关于硫化钠及其水合物经静脉给药和腹腔给药的毒性研究，但仅限于急性毒性检测，经口毒性及系统的安全性评价尚未见报道。本文采用了经口给药急性毒性试验、重复给药毒性试验和致畸试验对硫化钠的安全性进行了初步评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采用SPF级SD大鼠，雌雄各半，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(川)2018-19。

1.2 主要试剂与设备

1.2.1 受试药物及处理 五水硫化钠，由山西省某化工集团股份有限公司提供，纯度为96.5%~101.5%，批号为20191012，样品为白色粉末，易溶于水。试验时用蒸馏水作溶剂配制成所需浓度。

1.2.2 主要设备 BS800全自动生化分析仪(迈瑞，中国)，XT-2000i型全自动血细胞分析仪(希森美康，日本)，ACL-TOP全自动血凝分析仪(沃芬，美国)，URIT-180尿液分析仪(优利特，中国)。

1.3 试验方法

1.3.1 急性毒性试验 采用霍恩法进行试验[7]，将SD大鼠40只，体质量180~220 g，随机分为4组，每组10只，雌雄各半。设215、464、1 000、2 150 mg/kg组，按10 mL/kg一次经口灌胃。染毒后观察两周内动物的一般状况、中毒表现及死亡情况。求出半数致死剂量(LD50)值及95%可信区间。

1.3.2 重复给药毒性试验 采用灌胃法[8]，选用SD大鼠80只，体质量70～94 g，随机分成4组，根据大鼠LD50大约1/7剂量设置高剂量为120 mg/㎏，中、低剂量分别为60和30 mg/kg，另设蒸馏水对照组。每天按5 mL/kg经口灌胃给药，连续给药90 d，每周记录体质量、摄食量和食物利用率。试验结束时，计算总增体质量、总摄食量、总食物利用率，收集动物尿液，检测尿常规，测定各项血液学血生化指标，解剖动物观察内脏改变，称肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺、脑、子宫、卵巢、睾丸、附睾、胸腺和肾上腺等脏器湿质量，计算脏体比，取对照组及高剂量组大鼠多种器官组织作病理学检查。

1.3.3 致畸试验 采用常规致畸试验，操作参照文献[9]。将雌、雄SD大鼠按2∶1同笼交配，以查见阴栓的当天为妊娠第0天，将查见阴栓的雌鼠随机分成4组，每组17只，剂量设置同1.3.2。在妊娠第6~15 d，每天按5 mL/kg经口灌胃染毒。于妊娠第0、6、9、12、15天称体质量，调整灌胃量。于妊娠第20天称体质量后经麻醉处死动物，记录总着床数、活胎数、死胎数、吸收胎数和黄体数，称取子宫连活胎总质量、活胎质量、卵巢质量、胎盘质量并量取胎鼠身长，逐个检查胎鼠的外观、将1/2胎鼠放入Bouin'S液中固定两周检查内脏，其余胎鼠去内脏后经固定、染色、透明后检查骨骼。

1.4 统计学方法

应用SPSS 16.0 for Windows软件。重复给药毒性试验数据经方差齐性检验，若方差齐，进行方差分析，如P＜0.05则用Dunnett法进行两两比较；若方差不齐，改用秩和检验，如P＜0.05则用Dunnett'sT3法进行两两比较。致畸试验中，计量资料用±s表示，采用方差分析，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 急性经口毒性试验

染毒后215、464 mg/kg组未出现中毒症状及死亡，而1 000和2 150 mg/kg组出现共济失调和呼吸困难等症状，部分动物恢复，部分动物染毒5 min内出现死亡，死亡前出现呼吸抑制，死亡后大体解剖发现胃肠胀气，胃肠道病理镜检未见异常。存活动物继续喂养14 d。观察期内未见动物死亡。硫化钠对雌雄SD大鼠急性经口LD50分别为794和926 mg/kg。见表1。

表1 硫化钠染毒后SD大鼠急性经口毒性试验结果(n=5)

2.2 重复给药毒性试验

受试物以30、60、120 mg/kg经口给予雌雄SD大鼠90 d。试验期间动物健康状况良好，体质量持续增长，未见动物死亡。动物血常规和血凝、血生化和电解质的结果如表2和表3。部分指标的改变虽有统计学意义，但无剂量反应关系或无生物学意义。

表2 硫化钠对SD大鼠末期血液学检验结果(±s，n=10)

表2 硫化钠对SD大鼠末期血液学检验结果(±s，n=10)

RBC：红细胞计数；HGB：血红蛋白；WBC：白细胞；NEUT：中性粒细胞；LY：淋巴细胞；MONO：单核细胞；EOS：嗜酸性细胞；BAS：嗜碱性细胞；PLT：血小板计数；HCT：红细胞压积；APTT：活化部分凝血活酶时间；PT：凝血酶原时间.与对照组比较，*P＜0.05.

性别雄雌剂量/(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 RBC/(×1012/L)8.50±0.38 8.57±0.44 8.18±0.31 8.63±0.42 7.92±0.34 8.09±0.85 8.01±0.57 8.22±0.37 HGB/(g/L)157.70±5.36 159.10±5.07 153.40±5.87 158.40±3.10 152.70±7.12 154.00±15.50 150.20±8.27 155.70±5.93 WBC/(×109/L)8.57±1.26 7.66±1.73 9.78±2.36 6.16±1.60*3.63±0.96 3.17±1.11 5.12±1.67 4.07±0.95 NEUT/%17.63±7.76 22.62±11.02 14.80±3.81 23.50±4.47 11.49±3.89 19.88±7.98*11.70±6.02 15.53±5.64 LY/%73.59±8.85 67.04±10.43 76.78±4.45 66.12±4.36 79.24±5.23 69.81±7.21*80.11±6.55 74.62±8.03 MONO/%6.46±2.05 7.14±1.70 6.21±1.56 6.15±1.46 5.60±1.43 7.13±2.35 5.16±1.73 6.21±1.26性别雄雌剂量/(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 EOS/%2.42±0.49 3.33±0.95 2.31±0.63 4.34±1.82*3.78±0.77 3.27±1.33 3.15±0.60 3.80±2.18 BAS/%0.10±0.07 0.07±0.05 0.10±0.05 0.09±0.08 0.09±0.11 0.11±0.16 0.08±0.10 0.04±0.00 PLT/(×109/L)1026.90±71.213 998.80±122.71 977.30±132.88 1073.80±142.05 960.20±58.74 1039.10±158.37 1024.00±99.46 967.70±114.10 HCT/(L/L)0.44±0.02 0.44±0.01 0.43±0.01 0.44±0.01 0.44±0.02 0.45±0.04 0.43±0.02 0.44±0.02 APTT/s 19.71±0.58 19.21±1.34 22.42±1.28*20.18±2.34 19.95±1.88 18.52±2.97 21.03±1.62 21.11±1.41 PT/s 11.99±0.91 11.77±0.58 12.94±1.29 12.39±1.03 9.76±0.56 9.89±0.47 9.45±0.59 9.41±0.29

表3 硫化钠染毒后SD大鼠末期血生化及电解质检验结果(±s，n=10)

表3 硫化钠染毒后SD大鼠末期血生化及电解质检验结果(±s，n=10)

TP：总蛋白；ALB：白蛋白；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；ALP：碱性磷酸酶；GGT：谷氨酰转肽酶；BUN：尿素氮；CREA：肌酐；TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；GLU：血糖；K：血清钾；Na：血清钠；Cl：血清氯.与对照组比较，*表示P＜0.05.

性别雄雌剂量(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 TP/(g/L)54.03±1.43 53.51±1.75 52.99±1.88 53.86±1.90 59.80±3.61 58.87±4.72 57.32±2.28 59.62±4.11 ALB/(g/L)29.85±0.82 29.68±0.76 29.50±1.21 29.97±1.08 33.76±2.04 33.39±2.35 32.63±1.33 33.53±1.80 ALT/(U/L)57.12±27.46 64.24±52.13 49.57±11.78 60.54±20.69 23.40±4.14 27.58±6.19 23.34±4.30 25.03±8.89 AST/(U/L)175.46±61.17 198.72±81.03 161.25±33.39 223.13±59.93 117.51±26.15 141.54±50.48 108.52±21.96 133.29±81.66 ALP/(U/L)96.31±15.38 99.85±12.71 105.03±16.36 99.70±10.12 69.74±14.64 64.30±16.47 67.02±14.67 63.82±18.91 GGT/(U/L)0.40±0.16 0.38±0.19 0.42±0.23 0.34±0.13 0.33±0.24 0.41±0.34 0.39±0.24 0.43±0.25 BUN/(mmol/L)6.78±0.70 7.09±0.48 6.63±0.86 7.31±0.47 8.62±1.10 9.53±0.78 8.82±1.18 9.26±0.90性别雄雌剂量(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 CREA/(μmol/L)63.21±11.27 66.88±5.50 58.26±6.01 70.64±12.19 61.97±7.20 57.41±11.90 60.63±7.96 59.87±6.48 TC/(mmol/L)1.35±0.28 1.39±0.19 1.25±0.32 1.40±0.21 1.90±0.22 1.80±0.40 1.72±0.30 1.90±0.37 TG/(mmol/L)0.57±0.24 0.56±0.23 0.60±0.21 0.56±0.17 0.63±0.16 0.73±0.35 0.52±0.11 0.49±0.09 GLU/(mmol/L)8.13±0.95 8.03±0.41 9.33±1.73 9.03±1.51 8.84±0.91 7.85±1.22 9.71±1.34 8.93±0.90 K/(mmol/L)5.18±0.35 5.26±0.24 5.08±0.32 5.29±0.36 4.91±0.24 5.21±0.36 4.87±0.36 5.20±0.35 Na/(mmol/L)144.22±0.81 144.56±0.55 144.40±0.19 144.17±1.07 147.57±2.50 145.35±2.60 146.17±0.97 145.50±0.96 Cl/(mmol/L)104.49±1.24 105.82±0.99*105.29±1.04 106.01±1.47*107.73±2.45 107.12±1.75 106.91±0.83 107.27±1.01

重复给药毒性试验中，解剖大体观察发现硫化钠120 mg/kg剂量组大鼠肠道出现点状出血灶。病理镜检结果显示，120 mg/kg剂量组大鼠消化道观察到主要以小肠黏膜坏死脱落和大肠肠壁各层炎细胞浸润为主要特征的异常改变(见图1)。其他器官组织仅见动物自发病变。在本试验条件下，该受试物对SD大鼠的未观察到有害作用剂量(no-observed adverse effect level，NOAEL)为60 mg/kg。

2.3 致畸试验

2.3.1 硫化钠对SD孕鼠体质量的影响 试验期间，孕鼠未出现母体毒性及死亡。由表4可见，硫化钠3个剂量组对孕鼠各时点体质量的影响与对照组间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.3.2 硫化钠对SD大鼠胎仔的影响 与对照组比较，硫化钠120 mg/㎏剂量组17只受孕大鼠中，3只孕鼠共发现4只死胎，死胎百分率显著增加(P＜0.05)；有1只受孕大鼠所产17只仔鼠中，7只出现短肢，外观畸形窝发生率显著增加(P＜0.05)。未见受试物对胎仔骨骼及内脏发育产生不良影响。见表5。

图1 120 mg/kg硫化钠对消化道的病理学损伤(×100倍)

表4 硫化钠对SD孕鼠体质量的影响(±s，n=17)

表4 硫化钠对SD孕鼠体质量的影响(±s，n=17)

剂量/(mg/kg)对照组硫化钠30 60 120妊娠天数第0天297.4±17.0 293.2±17.8 283.6±19.7 286.4±18.5第6天337.7±20.6 329.2±17.2 325.9±22.5 326.3±20.6第9天357.1±25.1 345.2±18.9 341.9±22.1 339.1±19.1第12天375.6±31.0 361.0±23.5 360.1±26.1 358.8±19.7第15天397.5±33.6 388.6±30.9 379.3±28.4 382.6±20.3第20天494.0±43.5 469.4±47.1 461.5±43.0 463.9±36.5

表5 硫化钠对SD孕鼠胎仔的影响(±s)

表5 硫化钠对SD孕鼠胎仔的影响(±s)

与对照组比较，*P＜0.05.

剂量/(mg/kg)对照组硫化钠30 60 120交配鼠数/只20 19 20 20活胎数/只254 223 222 222窝平均活胎数/只14.9±2.5 13.1±4.1 13.1±4.1 13.1±4.0吸收胎数/只3433死胎数/只0014死胎百分率/%0.00 0.00 0.44 1.75*短肢发生数/个0007短肢发生率/%000 3.15外观畸形窝发生数/个0001外观畸形窝发生率/%000 5.88*子宫连胎总质量/g 103.0±16.4 89.0±26.0 91.6±29.3 93.2±28.5胎仔平均体质量/g 4.50±0.54 4.49±0.15 4.47±0.22 4.81±0.52胎仔平均身长/cm 4.10±0.14 4.09±0.12 4.09±0.05 4.14±0.19

3 讨论

本研究急性经口毒性试验中，大鼠染毒后出现共济失调和呼吸困难等症状，并于染毒后几分钟内死亡，死亡前有呼吸抑制，死亡后大体解剖发现肠道有胀气，胃肠道病理镜下检查未见异常。由于大鼠出现了呼吸困难，呼吸抑制等作用，可能因为神经系统或呼吸系统出现了急性损伤造成了死亡，应在今后的研究中注意对脑和肺部急性损伤进行大体观察和病理镜检。

根据文献[10]报道，我们推测口服硫化钠后在肠道经硫酸盐还原菌发酵生成大量硫化氢，过高浓度的硫化氢无法在肠道内通过酶途径等解毒过程清除，能引起硫化氢中毒，对皮肤黏膜有腐蚀作用，这可能是硫化钠对肠道黏膜造成损伤的原因。同时它会参与体内炎症反应，引起慢性肠道炎症性疾病、结直肠癌等相关疾病。本研究中重复给予硫化钠90 d后，120 mg/kg剂量组能引起明显肠道炎性反应，结肠的炎性反应可能与过量硫化氢在结肠产生的多种效应有关，除了抑制细胞的呼吸功能，促凋亡作用，硫化氢还可降低结肠上皮细胞对丁酸盐的氧化作用，导致黏膜通透性增加，肠道屏障功能受损[11]。

硫化钠是常见的硫化氢供体[12]，其致畸试验鲜见报道，经口研究更少。有文献报道硫化氢对斑马鱼胚胎和仔鱼均有剂量依赖性的发育毒性和畸形性[13]。另有研究[14]发现，硫化氢在较低的浓度短时间释放，对人精子具有毒性，会降低人精子活力。在本研究的致畸试验中我们经口给予硫化氢供体硫化钠，发现120 mg/kg剂量组中死胎百分率显著增加，外观畸形窝发生率显著增加，提示硫化钠可能有胚胎毒性和外观致畸毒性。我们观察到120 mg/kg硫化钠对孕鼠进食量影响有降低作用，但差异无统计学意义，并且对大鼠肠道黏膜造成了损伤，可能影响动物营养物质吸收，从而影响仔鼠发育。致畸试验的结果虽然有统计学意义，但是17只孕鼠中仅1只孕鼠的胎仔存在外观畸形，不足以判定受试物的致畸性。试验结果未出现明显毒性，这可能与高剂量组(120 mg/kg)设计剂量较低有关，今后尚需提高剂量重复试验确定结果。高剂量应保证重复给药毒性试验大鼠出现明显中毒反应及少量死亡；致畸试验大鼠出现明显胚胎毒性或轻微的母体毒性反应。

所以，关于硫化钠的安全性研究，以及它的生理和病理作用机制仍有待进一步研究明确。