化瘀宁坤汤对盆腔炎大鼠TLR4/NFκB/COX2信号通路及炎症反应的影响

李 颖，张霄峰，赵 敏，张 洋

（1.本溪市中医院妇科，辽宁 本溪 117000；2.本溪市中医院高医门诊，辽宁 本溪 117000；3.大连医科大学附属第二医院中医科，辽宁 大连 116023）

盆腔炎属女性生殖道感染疾病，可因炎症轻重及范围大小出现不同临床症状，如下腹痛、发热、阴道分泌物增加等症状，严重时影响生育，严重影响患者身心健康[1]。因此，寻找安全有效的治疗方法对于盆腔炎治疗极为重要。中药化瘀宁坤汤可有效改善血液循环、促进炎症吸收和增强机体免疫功能，从而达到缓解疾病目的；在治疗盆腔炎中具有一定疗效，且已经应用于临床[2]，但其作用机制尚不完全明确。Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核转录因子kappaB（nuclear kappa B，NF-κB）/环氧化酶2（cyxlooxygenase 2，COX2） 信号通路在炎症免疫过程中起重要的信号转导作用，TLR受体信号通路可调控炎症免疫反应，从而达到调节炎症目的[3]。推测化瘀宁坤汤可能影响TLR4/NFκB/COX2信号通路从而实现对盆腔炎的保护。因此，机械损伤子宫内膜组织后混合菌液0.2 mL注入双侧子宫内构建盆腔炎大鼠模型，探讨化瘀宁坤汤对盆腔炎大鼠子宫内膜组织炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性SD大鼠、SPF级、北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2018-0014，体质量（200±20）g，所有大鼠均在（12/12）h光照/黑暗、温度（25±1）℃、湿度（50±5）%环境中常规饲养。本实验均经本院动物伦理委员会审核并批准。

1.2 药品、试剂及仪器

化瘀宁坤汤：败酱草20 g，三棱、莪术、赤芍、昆布各15 g，槟榔12 g，附子、桂枝各10 g，水蛭5 g。上述药物均购自张仲景大药房，药物制成1 g·mL-1生药备用。混合菌液（大肠埃希菌:金黄色葡萄球菌:乙型溶血性链球菌2:1:1混合，混合菌液密度：生理盐水制成每毫升3×109个），菌种均由南京中医药大学提供。TLR4抑制剂Tak-242（上海兰浚生物科技有限公司，货号：GC16148）；苏木素-伊红（hematoxylin-easine，HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120）；大鼠白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，一抗兔抗 TLR4、NF-κB、COX2、GAPDH（美国abcam公司，货号分别为：ab197742、ab208348、ab13556、ab28849、ab15191、ab181602）；免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）检测试剂盒（上海康朗生物科技有限公司，货号：96T）；蛋白凝胶成像系统（Tanon公司，型号：4600）。

1.3 模型制备及分组

实验分为假手术组、模型组、化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组、化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组，每组10只。除假手术组外，其余大鼠参考文献[4]建立盆腔炎大鼠模型，1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，无菌条件下消毒，下腹正中切口0.8～1 cm，开腹暴露出子宫，1 mL注射器机械损伤子宫内膜组织，之后混合菌液0.2 mL注入双侧子宫内，逐层缝合切口。假手术组做相同处理，但不损伤子宫内膜组织和注入混合菌液，其余步骤相同。造模15 d后给药，化瘀宁坤汤组和化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组给予化瘀宁坤汤灌肠治疗，根据大鼠和人给药等效剂量，按体表面积折算剂量为6.25 mL[5]，灌肠前将药物加热至42 ℃左右，排空大小便，导尿管插入直肠灌药，保留40 min以上，每日1次。TLR4抑制剂组、化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组腹腔注射1 mg·kg-1Tak-242[6]，隔天1次，假手术组和模型组分别腹腔注射和灌肠等体积生理盐水，20 d为1个疗程。

1.4 子宫系数检测

实验结束后，腹主动脉取血5 mL，3 000 rpm/min离心10 min，收集上清置-80 ℃冰箱中保存。立即处死大鼠，观察腹腔积液及子宫情况，取出子宫并称量，部分子宫置于4%多聚甲醛中固定，部分置于-80 ℃冰箱中保存待检。

根据子宫重量得子宫系数=子宫质量÷体质量。

1.5 HE检测子宫组织形态

4%多聚甲醛中取出子宫组织，常规切片后HE染色观察，四分位法病理评分：按照子宫粘连扩张情况、慢性炎症浸润、内膜充血水肿、上皮变性坏死及上皮细胞增生赋值0～3分。

1.6 ELISA检测血清中炎症因子IL-1β、TNF-α水平

严格按照大鼠IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒说明书检测血清中IL-1β、TNF-α水平。

1.7 免疫浊度法检测血清中Ig水平

免疫浊度法检测血清中IgG、IgA和IgM水平。

1.8 蛋白免疫印迹检测子宫组织中TLR4、NF-κB p65、COX2蛋白水平

取部分子宫组织，蛋白裂解液裂解细胞，测定蛋白含量后上样30 ug，SDS-PAGE电泳后蛋白转移至PVDF膜，封闭后，用一抗TLR4、NF-κB、COX2、GAPDH在4 ℃下孵育过夜，次日二抗孵育2 h，化学发光液显色后，用Image-J软件定量扫描蛋白条带灰度值，蛋白相对表达水平=待测蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.9 统计学方法

统计学软件SPSS 25.0进行数据分析，计量数据以平均数±标准差（±s）描述，比较行单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化瘀宁坤汤对大鼠子宫系数的影响

与假手术组相比，模型组大鼠子宫系数升高（P＜0.05）；与模型组相比，化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组、化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组大鼠子宫系数降低（P＜0.05）；分别与化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组相比，化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组大鼠子宫系数降低（P＜0.05）。见表1。

表1 5组大鼠子宫系数比较（± s，n = 10） mg·g-1

表1 5组大鼠子宫系数比较（± s，n = 10） mg·g-1

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与化瘀宁坤汤组比较，▲P＜0.05；与TLR4抑制剂组比较，□P＜0.05

组别 子宫系数假手术组 2.19±0.43模型组 11.24±1.53#化瘀宁坤汤组 5.85±0.84△TLR4抑制剂组 7.47±0.92△化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组 3.57±0.25△▲□

2.2 化瘀宁坤汤对大鼠血清中炎症因子IL-1β、TNF-α水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组、化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05）；分别与化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组相比，化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05）。见表2。

表2 5组大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比较（± s，n = 10） ng·mL-1

表2 5组大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比较（± s，n = 10） ng·mL-1

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与化瘀宁坤汤组比较，▲P＜0.05；与TLR4抑制剂组比较，□P＜0.05

组别 IL-1β TNF-α假手术组 7.14±0.86 4.86±0.85模型组 34.15±2.45# 20.88±1.87#化瘀宁坤汤组 14.85±1.52△ 13.41±1.14△TLR4抑制剂组 19.37±1.95△ 11.52±1.22△化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组 9.48±1.12△▲□ 6.48±0.74△▲□

2.3 化瘀宁坤汤对大鼠血清中IgG、IgA和IgM水平的影响

与假手术组相比，模型组血清中IgG、IgA水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组、化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组大鼠血清中IgG、IgA水平升高（P＜0.05）；分别与化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组相比，化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组大鼠血清中IgA水平升高（P＜0.05）。见表3。

表3 5组大鼠血清中IgG、IgA和IgM水平比较（± s，n = 10） mg·mL-1

表3 5组大鼠血清中IgG、IgA和IgM水平比较（± s，n = 10） mg·mL-1

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与化瘀宁坤汤组比较，▲P＜0.05；与TLR4抑制剂组比较，□P＜0.05

组别 IgG IgA IgM假手术组 11.98±0.87 3.72±0.45 1.51±0.14模型组 8.47±0.73# 1.48±0.15# 1.47±0.41化瘀宁坤汤组 10.14±1.24△ 2.54±0.32△ 1.50±0.17 TLR4抑制剂组 9.85±0.91△ 2.16±0.27△ 1.48±0.46化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组 10.98±1.45△ 3.16±0.47△▲□1.49±0.38

2.4 化瘀宁坤汤对大鼠子宫内膜组织的影响

与假手术组相比，模型组子宫粘连扩张、慢性炎症浸润、内膜充血水肿、上皮变性坏死、上皮细胞增生病理评分升高（P＜0.05）；与模型组相比，化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组、化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组子宫粘连扩张、慢性炎症浸润、内膜充血水肿、上皮变性坏死、上皮细胞增生病理评分降低（P＜0.05）；分别与化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组相比，化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组子宫粘连扩张、慢性炎症浸润、内膜充血水肿、上皮变性坏死、上皮细胞增生病理评分降低（P＜0.05）。见图1、表4。

表4 5组大鼠子宫内膜组织中病理评分比较（± s，n = 10） 分

表4 5组大鼠子宫内膜组织中病理评分比较（± s，n = 10） 分

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与化瘀宁坤汤组比较，▲P＜0.05；与TLR4抑制剂组比较，□P＜0.05

组别 粘连或扩张 慢性炎症浸润 内膜充血水肿 上皮变性坏死 上皮细胞增生假手术组 0.28±0.06 0.45±0.08 0.38±0.02 0.24±0.04 0.28±0.04模型组 2.52±0.48# 2.79±0.49# 2.04±0.41# 2.14±0.12# 2.47±0.35#化瘀宁坤汤组 1.34±0.35△ 1.84±0.42△ 1.25±0.34△ 1.47±0.42△ 1.57±0.28△TLR4抑制剂组 1.64±0.28△ 1.38±0.29△ 1.48±0.46△ 1.76±0.38△ 1.86±0.34△化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组 0.57±0.08△▲□ 0.87±0.21△▲□ 0.76±0.14△▲□ 0.87±0.14△▲□ 0.76±0.45△▲□

图1 5组大鼠子宫内膜组织形态变化（HE染色，×100）

2.5 化瘀宁坤汤对大鼠子宫组织中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平的影响

与假手术组相比，模型组子宫组织中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组、化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组子宫组织中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平降低（P＜0.05）；分别与化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组相比，化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组子宫组织中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平降低（P＜0.05）；分别与化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组相比，化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组子宫组织中TLR4、COX2蛋白水平降低（P＜0.05）；与化瘀宁坤汤组相比，化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组子宫组织中NF-κB蛋白水平降低（P＜0.05）。见图2、表5。

表5 5组大鼠子宫组织中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平比较（± s，n = 10）

表5 5组大鼠子宫组织中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平比较（± s，n = 10）

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与化瘀宁坤汤组比较，▲P＜0.05；与TLR4抑制剂组比较，□P＜0.05

组别 TLR4 NF-κB COX2假手术组 0.13±0.03 0.29±0.04 0.26±0.04模型组 0.42±0.05# 1.02±0.18# 0.73±0.11#化瘀宁坤汤组 0.26±0.03△ 0.43±0.08△ 0.45±0.05△TLR4抑制剂组 0.21±0.02△ 0.36±0.05△ 0.52±0.04△化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组 0.05±0.01△▲□ 0.25±0.03△▲ 0.23±0.03△▲□

图2 5组大鼠子宫组织中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平

3 讨论

盆腔炎是目前临床上难治疾病，西医治疗以抗生素为主，但易产生耐药性和二重感染，不易长期使用；中医治疗不仅副作用少，改善炎症同时可增强免疫力，从而抵御微生物侵袭[7]。盆腔炎归于祖国医学“少腹痛”“带下病”“痛经”“月经不调”“不孕”“热入血室”等范畴，因湿、热、寒、癖蓄积胞宫胞络、气血不畅、日久癖血内阻而发病；因此在治疗上以清热利湿、活血化瘀、消肿排脓等为主[8]。化瘀宁坤汤中水蛭、附子均为君药，其中水蛭具有活血、化瘀、通络之功效；附子具有温经散寒、助阳扶正之功效[9]。三棱、莪术、赤芍、桂枝共为臣药，其中三棱、莪术两药擅破血行气、消积止痛；赤芍活血化瘀、消肿止痛；桂枝温经通阳、温阳祛湿[10]。败酱草、槟榔共为佐药，其中败酱草苦能燥湿，有活血化瘀止痛之功效；槟榔行下焦之气、俾气行则血行[11]。本研究发现，与假手术组相比，模型组大鼠子宫系数，子宫粘连扩张、慢性炎症浸润、内膜充血水肿、上皮变性坏死、上皮细胞增生病理评分升高；与模型组相比，化瘀宁坤汤组大鼠子宫系数，子宫粘连扩张、慢性炎症浸润、内膜充血水肿、上皮变性坏死、上皮细胞增生病理评分降低。提示盆腔炎大鼠子宫出现粘连扩张、炎症、充血水肿、上皮坏死、上皮增生等多种病理现象，导致子宫肿胀、体积变大，子宫系数增大，子宫损伤严重。经化瘀宁坤汤治疗后，子宫粘连扩张、炎症、水肿、上皮坏死、细胞增生等现象得以缓解，逐渐恢复，实现对盆腔炎子宫的保护。

IL-1β、TNF-α均为炎症因子，均可促进炎症反应，其中IL-1β是由巨噬细胞分泌的重要炎症细胞因子，可促进促炎因子在内皮细胞聚集从而参与盆腔炎炎症反应[12]。TNF-α是炎症反应的最早阶段，能够激活中性粒细胞和淋巴细胞，从而促进其他炎症因子的释放[13]。Ig属机体抗感染的重要屏障，可在补体协同作用下杀死或溶解病原微生物，属机体抗感染免疫中重要防御机制。IgG、IgA和IgM均作为Ig，发挥体液免疫作用，其中IgG更易透过毛细血管壁，从而发挥抗感染、抗毒素和调理功效；IgA具有抗菌、抗病毒、抗毒素作用；IgM可参与肿瘤细胞破坏作用，属高能效抗体[14]。盆腔炎中免疫功能发生障碍影响机体功能。本研究发现，与假手术组相比，模型组血清中IL-1β、TNF-α水平升高，IgG、IgA水平降低；与模型组相比，化瘀宁坤汤组血清中IL-1β、TNF-α水平降低，IgG、IgA水平升高。提示盆腔炎中炎症现象明显，免疫功能下降，机体更易感染病毒、细菌、毒素等，导致加重机体病情。化瘀宁坤汤治疗后促进炎症吸收和增强机体免疫功能从而缓解疾病进程，实现对盆腔炎的保护。

TLR4/NFκB/COX2信号通路在炎症和免疫信号通路中发挥重要作用，TLR4作为重要免疫炎症调控因子，可启动机体炎症链式反应，存在于血管内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞等多种细胞中[15]；NFκB作为重要核转录因子，在炎症发生和发展中起重要作用[16]；COX2属膜结合蛋白，是合成前列腺素和血栓素的关键蛋白，是花生四烯酸代谢过程中关键限速酶，广泛存在于机体免疫、炎症过程中[17]。TLR4被生物配体识别并结合后可促进下游NFκB活化，从而促进下游多种促炎因子（如IL-1β、TNF-α）等释放，促进机体损伤[18-19]；同时NFκB可调控下游炎症蛋白COX2表达，COX2亦可由IL-1β、TNF-α诱导，从而诱发炎症反应[20]。本研究发现，与假手术组相比，模型组子宫组织中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平升高，提示盆腔炎大鼠子宫组织中TLR4/NFκB/COX2信号通路处于激活状态，TLR4激活机体炎症反应状态，促进NFκB活化，从而促进炎症蛋白COX2表达、促炎因子IL-1β、TNF-α等释放，加重疾病进程。与模型组相比，化瘀宁坤汤组、TLR4抑制剂组、化瘀宁坤汤+TLR4抑制剂组子宫组织中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平降低，提示化瘀宁坤汤与TLR4抑制剂功能类似，均可抑制TLR4活化，使NFκB活化降低，从而使促炎蛋白、促炎因子水平降低，减少炎症水平，同时提高免疫力，实现对盆腔炎的保护。

综上所述，化瘀宁坤汤可抑制TLR4/NFκB/COX2信号通路从而降低盆腔炎大鼠子宫内膜组织的炎症反应，实现对盆腔炎的保护。但化瘀宁坤汤成分复杂，亦可能通过别的信号通路实现对盆腔炎的保护，有待进一步研究。