二肽基肽酶-4在瘢痕疙瘩中的表达情况研究

梁仲尧　岑瑛

[摘要]目的：探讨二肽基肽酶-4（DPP4）在瘢痕疙瘩中的表达情况。方法：分别获取切除术后的瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织，然后通过蛋白免疫印迹方法、定量聚合酶链反应，比较二者DPP4基因在蛋白和mRNA水平上表达的差异。结果：与正常皮肤组织相比，DPP4蛋白在瘢痕疙瘩组织中的表达高于正常皮肤，差异有统计学意义（P<0.05），DPP4基因在mRNA水平上的表达高于正常皮肤（P<0.05）。结论：DPP4在瘢痕疙瘩中的表达上升，DPP4可能在促进成纤维细胞活化、纤维化形成方面有一定作用。

[关键词]瘢痕疙瘩;纤维化;二肽基肽酶-4;实时聚合酶链反应;蛋白免疫印迹;基因表达;成纤维细胞

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）01-0087-03

Study on the Expression of Dipeptidyl Peptidase-4 in Keloids

LIANG Zhongyao1，CEN Ying2

（1.West China Clinical Medical College of Sichuan University，Sichuan University，Chengdu 610000，Sichuan，China;2.Department of Plastic and Aesthetic Surgery，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610000，Sichuan，China）

Abstract： Objective To explore the expression of dipeptidyl peptidase-4 in keloids. Methods The keloid tissue and normal skin tissue after resection were obtained， and then the differences in the expression of DPP4 gene between the two were compared by Western blotting and quantitative polymerase chain reaction. Results Compared with normal skin tissue， the expression of DPP4 protein in keloid tissue was higher than that in normal skin， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of DPP4 gene at mRNA level was higher than that in normal skin （P<0.05）. Conclusion The expression of DPP4 in keloids is increased. DPP4 may play a role in promoting fibroblast activation and fibrosis formation.

Key words： keloid; fibrosis; Dipeptidyl Peptidase-4; real-time polymerase chain reaction; blotting western; gene expression; fibroblast

瘢痕疙瘩（keloid）是整形外科中一類常见的皮肤纤维化疾病，发病机制大多与胶原纤维过度修复增生有关，其主要特征表现为高出于皮肤表面、侵袭性生长和容易复发。有研究表明，在各种上皮细胞表面广泛分布着一类T细胞表面抗原——二肽基肽酶-4（Dipeptidyl peptidase 4，DPP4）即CD26，是一种细胞膜表面的丝氨酸蛋白酶，其在成纤维细胞表面也有分布[1]。有研究表明DPP4阳性成纤维细胞是一类功能更加活跃的细胞亚群，其主要参与形成细胞外基质的过度纤维化[2]。因此，临床医生很难不将瘢痕疙瘩的形成与DPP4的表达联系在一起。本文中，笔者使用了蛋白免疫印迹、定量聚合酶链反应两种方法，以探讨瘢痕疙瘩中DPP4在蛋白和mRNA水平上的表达情况，进一步说明瘢痕疙瘩的形成与DPP4表达的相关性，现报道如下。

1  材料和方法

1.1 材料来源：10例瘢痕疙瘩组织和10例正常皮肤组织分别来源于四川大学华西医院整形美容外科瘢痕疙瘩切除术后的多余组织和腹壁整形术、巨乳切除术后的多余皮肤组织。取得患者知情同意，然后分别获取切除术后的瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织。患者合并有瘢痕疙瘩、增生性瘢痕疾病、其他皮肤疾病或癌症不纳入采纳范围。本研究符合伦理学要求。

1.2 蛋白免疫印迹法：将正常皮肤和瘢痕疙瘩组织剪碎后，加入RIPA裂解液，裂解完成后在4℃，12 000 g条件下离心5 min，测定蛋白质浓度后用5×上样缓冲液稀释5倍，然后按照电泳（先80 V条件下电泳30 min，然后调整电压至120 V继续电泳使maker条带明显分离）、转膜（4 ℃条件下过夜）、封闭（用5%脱脂奶粉TBST溶室温封闭1 h）、孵育（一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h）的顺序进行蛋白免疫印迹实验。实验目的：确定DPP4蛋白在正常皮肤和瘢痕疙瘩中的表达情况。

1.3 定量聚合酶链式反应法（Quantitative polymerase chain reaction，QPCR）：在液氮中将正常皮肤和瘢痕疙瘩组织研磨成粉末，按照离心柱法进行组织总RNA提取，然后按照逆转录方法将RNA转录为cDNA，最后利用SYBR法进行荧光定量PCR，以确定DPP4基因在正常皮肤和瘢痕疙瘩组织mRNA上的表达水平。

1.4 统计学分析：由Graphpad Prim 8.0.2软件和SPSS 26.0完成。

2  结果

2.1 蛋白免疫印迹实验结果：如图1～2所示，DPP4蛋白在瘢痕疙瘩中的表達量高于正常皮肤，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.2 QPCR结果：如图3所示，与正常皮肤组织相比，在瘢痕疙瘩组织上DPP4基因的mRNA表达水平更高，差异具有统计学意义（P<0.05）。

3  讨论

瘢痕疙瘩的主要发生原因为外伤刺激，是一种组织修复过度，纤维化无法正常受控的疾病。皮肤发生外伤后，成纤维细胞在损伤皮肤修复方面发挥着举足轻重的作用，且修复的早中晚期发挥的作用也各不相同。修复早期：成纤维细胞分泌各种细胞因子参与炎症反应[3];分泌细胞外基质参与肉芽组织形成，为其他细胞进行生物学功能提供结构支撑。修复晚期：成纤维细胞参与细胞外基质的降解与组织结构重塑，在外源性因素作用下，成纤维细胞功能发生紊乱，主要表现出以下3点能力：①“活化”的瘢痕疙瘩成纤维细胞表现出更强的迁移力和收缩力，从而导致瘢痕疙瘩向皮损区外侵袭;②瘢痕疙瘩成纤维细胞表现出更多的分泌胶原和细胞因子的能力，从而合成过多的细胞外基质;③向肌成纤维细胞的表型转化以及平滑肌肌动蛋白的表达上升会导致组织收缩。修复后期：瘢痕疙瘩成纤维细胞降解细胞外基质与组织结构重塑的功能发生紊乱，从而导致细胞外基质的堆积[4]。由此可见，成纤维细胞在瘢痕疙瘩的发生发展过程中起着主要作用，但成纤维细胞并不是由单一一群细胞亚群组成的。有文献[5]表明，成纤维细胞由一大类有着不同细胞表面抗原的成纤维细胞组成，其不仅会在增殖分化以及机体不同的生长阶段发生表型及功能的改变，而且在不同部位成纤维细胞表达细胞因子、增殖能力以及细胞表型方面都有一定差异，在皮肤、真皮层和表皮层的成纤维细胞组成上也表现出明显的异质性。

在临床实践中，笔者发现不同患者以及不同部位来源的瘢痕疙瘩其治疗效果有差异。这种治疗上的异质性促使笔者思考其是否与瘢痕疙瘩的异质性有关。瘢痕疙瘩不能精准化治疗以及复发问题一直是治疗的重点难点[6]，而对瘢痕疙瘩进行更加准确的靶向治疗的方法就是定位关键的致病亚群。目前不少的文献表明，DPP4阳性成纤维细胞可能是纤维化疾病中一类关键的细胞亚群。从小鼠动物模型里分选出来的成纤维细胞显示，表达En1基因的成纤维细胞是合成分泌细胞外基质，参与各种纤维化过程的主要效应细胞。而DPP4分子是一类可以作为区分En1表达情况的细胞表面标记物，在皮肤纤维化模型动物中，DPP4阳性成纤维细胞被认为是参与形成导致细胞外基质纤维化的主要细胞亚群[7]。在皮肤损伤过程中，活化的MAPK途径可以增加表皮IL-1α的分泌，从而诱导真皮成纤维细胞DPP4表达上升，抑制DPP4表达可以抑制损伤导致肿瘤发生的过程。DPP4在其他疾病中也起着作用，例如人们发现在淋巴瘤、黑素瘤等肿瘤疾病中，DPP4阳性与肿瘤细胞侵袭性增加有一定关系。在其他一些由外伤刺激诱发的肿瘤如宫颈癌等疾病中，DPP4分子在其中的真皮细胞与表皮细胞的表达都有显著的上调[8]。另外有文献表明，DPP4阳性细胞亚群在结直肠癌、Ewing肉瘤、间皮瘤以及血液系统肿瘤中有着更高的侵袭性、增殖力以及肿瘤恶性。有文献[9]表明，DPP4阳性成纤维细胞不仅在瘢痕疙瘩中比例增加，DPP4阳性成纤维细胞的TGF-β1、IGF-1、IL-6、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达也比DPP4阴性成纤维细胞要高。而抑制DPP4活性可以降低成纤维细胞增殖能力和TGF-β1分泌水平。

本研究通过蛋白免疫印迹和定量PCR法发现DPP4在瘢痕疙瘩中的表达上升，结合目前发现的DPP4阳性成纤维细胞亚群的功能活跃情况，进一步表明DPP4阳性成纤维细胞可能是导致瘢痕疙瘩形成的主要细胞亚群，为今后对瘢痕疙瘩进行精准治疗做了一些基础铺垫。

[参考文献]

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[6]羊乃康，孙琦.A型肉毒毒素与曲安奈德治疗瘢痕疙瘩的疗效和安全性比较[J].中国美容医学，2020，29（5）：66-69.doi：CNKI：SUN：MRYX.0.2020-05-023

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[9]Suwanai H，Watanabe R，Sato M，et al.Dipeptidyl peptidase-4 inhibitor reduces the risk of developing hypertrophic scars and keloids following median sternotomy in diabetic patients：a nationwide retrospective cohort study using the national database of health insurance claims of japan[J].Plast Reconstr Surg，2020，146（1）：83-89.doi： 10.1097/PRS.0000000000007935.

[收稿日期]2020-03-12

本文引用格式：梁仲尧，岑瑛.二肽基肽酶-4在瘢痕疙瘩中的表达情况研究[J].中国美容医学，2022，31（1）：87-89.