显微镜下多血管炎患者外周血髓样树突状细胞和调节性T细胞的表达及意义

丁秋燕，汪 伟，罗昊军，李 怡，丁涵露

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院肾内科，四川 成都 610072 ；2.四川省自贡市第四人民医院肾内科，四川 自贡 643000)

目前抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis，AAV)的病死率仍然较高，血清中的髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)抗体和蛋白酶3(proteinase 3，PR3)抗体是抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)的主要类型[1]。AAV肾损伤病理类型分为局灶性、新月体性、混合性和硬化性[2]，不同肾组织病理损伤的发生机制不清楚。我国原发性AAV中多血管炎(MPA)最常见，约占80%[1]。髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell，mDC)通过调控调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)等细胞的功能参与AAV的发病[3,4]，目前把Lin1-HLA-DR+CD11c+细胞定义为mDC，以CD4+CD25highCD127lowTreg细胞代表Treg细胞[5]，有报道AAV患者外周血DC表达下降[6]，但MPA患者外周血mDC、Treg细胞表达变化及其与伯明翰血管炎活动性评分(BVAS)、肾组织病理类型之间的关系不清楚。故本文拟对比观察活动期、缓解期MPA患者外周血mDC、Treg 细胞水平及其与BVAS评分、肾组织病理类型之间的关系，以期为MPA的发病机制和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2020年1月至2021年4月四川省人民医院确诊的45例MPA患者，纳入标准：①符合2012年Chapel Hill共识会议制定的《显微镜下多血管炎诊断及治疗指南》关于MPA的定义[7]；②初次诊断为原发性MPA、没有进行糖皮质激素及免疫抑制剂治疗；③血清P-ANCA抗体和MPO抗体均阳性。排除标准：合并PR3-ACNA阳性及其他继发性肾病的患者。男23例，女22例，年龄15～71岁[(45±26)岁]。选择同期健康志愿者15例，男8例，女7例，年龄24～68岁[(57±15)岁]。本研究获得我院伦理委员会审查批准(编号：2020393)，患者签署临床标本收集检测知情同意书。患者的BVAS评分按照文献计分，总分63分，15分以上为活跃，小于15分为缓解[8]。活跃组27例，缓解组18例。MPA患者中24例行肾穿刺病理检查，以WHO诊断标准进行MPA患者的病理诊断[2]，其中局灶性12例，新月体性5例，混合性7例。

1.2 实验材料CD4 APC-Cy7(557871)、CD25-BB700(566447)、CD127 PE-Cy7(560822)、Lineage cocktail 1 (lin 1,由CD3, CD14, CD16, CD19,CD20, CD56系列抗原混合单克隆抗体组成)(340546)、CD11C PE-Cy7(561356)、HLA-DR APC(560896)、IgG1 APC-Cy7(557873)、IgG1 BB700(566404)、IgG1 PE-Cy7(557872)、IgG2a APC(555576)，以上试剂来自BD公司。流式细胞仪为BD FACS CantoTM II。

1.3 外周血mDC细胞和CD4+CD25highCD127lowTreg细胞检测外周血中mDC/Treg数量检测采用全血单抗直接标记-溶血法；4.5 ml红细胞裂解液加至1.5 ml肝素抗凝全血，离心后向细胞沉淀中加入3 ml红细胞裂解液，PBS重悬细胞至200 μl,混匀后将细胞液移到试管，再以无菌PBS重悬至200 μl，取其中100 μl沉淀细胞加入Lin1-FITC抗体 4 μl、HLA-DR-APC抗体4 μl、CD11c-PE-cy7抗体2 μl，取上述另外100 ul沉淀细胞加入CD4-APC-Cy7抗体2 μl、CD25-BB700抗体5 μl，CD127-PE-Cy7抗体5 μl混匀，上述细胞和抗体的混匀液分别避光冰浴30分钟后加入无菌PBS 洗涤、离心、去上清液，然后每管细胞液用500 μl PBS重悬细胞,以 BD FACS CantoTM II流式细胞仪对上述细胞悬液进行检测。应用前向散射角与侧向散射角进行设门去除死细胞和细胞碎片排除碎片干扰。以侧向散射角和Lin1设门选择Lin1阴性细胞,分析mDC占外周血淋巴细胞的百分比，mDC细胞以Lin1-HLA-DR+CD11c+DC占外周血淋巴细胞的比例表示；以侧向散射角和CD4设门选择CD4阳性细胞，分析CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+细胞的百分比，Treg细胞以CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+淋巴细胞的比例表示。分别加入同型鼠单抗IgG1-APC-Cy7/IgG1- BB700/IgG1-PE-cy7，IgG2a-APC/IgG1PE-cy7作为阴性对照。上述结果分析均应用Diva软件。mDC细胞和Treg细胞设门见图1，图2。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析和t检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 活跃组与缓解组临床资料比较活跃组与缓解组白细胞计数、淋巴细胞计数、血小板计数、血压和血白蛋白等比较，差异无统计学意义(P>0.05)，活跃组血肌酐和血MPO抗体滴度较缓解组更高，血红蛋白较缓解组更低(P<0.05)，见表1。

图1 MPA患者外周血mDC占外周血淋巴细胞的比例 a：淋巴细胞在外周血中的百分比；b：Lin1阴性细胞在淋巴细胞中的百分比；c：HLA-DR和CD11c双阳性的细胞在Lin1阴性细胞中的百分比

表1 活跃期组与缓解期组临床资料比较

2.2 MPA患者外周血mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg细胞表达量及其与BVAS评分关系与缓解组及健康对照组比较，活跃组mDC占外周血淋巴细胞的百分比、CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占外周血CD4+细胞的百分比均下降(P<0.05)，缓解组及健康对照组上述细胞表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。mDC占外周血淋巴细胞的百分比、外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+细胞的百分比与BVAS评分均呈负相关(r分别为-0.64、-0.71，P<0.05)。

表2 MPA患者外周血mDC占比、CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占比表达水平比较 (%)

2.3 MPA患者外周血mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg细胞与肾组织病理类型的关系新月体性组与局灶性组、混合性组比较，BVAS评分明显升高，mDC占外周血淋巴细胞的百分比、CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占外周血CD4+细胞的百分比均下降(P<0.05)；局灶性组与混合性组比较，外周血mDC与CD4+CD25highCD127lowTreg细胞胞水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 MPA患者外周血mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg细胞、BVAS评分比较

3 讨论

本研究发现活跃组白细胞、淋巴细胞与缓解组无差异，但血肌酐和血MPO抗体滴度较缓解组更高而血色素更低，由于活跃组外周血mDC占淋巴细胞的百分比、CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+细胞的百分比均较缓解组下降，且mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg细胞数均与BVAS评分负相关，提示mDC和Treg细胞参与了MPA发病。

按照来源可把树突状细胞分为髓样DC(mDC)和淋巴样DC(pDC)，mDC主要位于外周血、肾、胃肠、皮肤黏膜、脾脏以及淋巴结等部位，研究发现AAV缓解期和急性期外周血mDC和pDC均是表达下降的[6]，CD11c主要表达在mDC上[9]，故本文以CD11c标记mDC细胞检测外周血mDC细胞表达。本文发现，与缓解组及健康对照组比较，MPA活跃组患者外周血mDC占淋巴细胞的百分比均下降，且其表达量与患者BVAS评分负相关。缓解组和健康对照组的mDC占淋巴细胞百分比相比无差异。外周血mDC表达量下降可能与骨髓祖细胞分化为树突状细胞减少有关，也可能与mDC促进CD4+T细胞分化为Th17细胞增多而分化为Treg细胞减少，导致肾组织炎症介质表达失衡，mDC从血液中转移到肾脏中有关，文献报道迁移至肾组织的DC摄取抗原后在肾组织局部或经5过淋巴、血液移行到淋巴组织富含T细胞的区域并提呈相应抗原给T细胞、活化致病T细胞而加重体内炎症损伤[9～11]，可见DC在AAV发病中具有重要作用。

核转录因子Foxp3(Foxp3)具有调控调节性T细胞生长、发育的作用，因此目前把Foxp3作为调节性T细胞的标记物。然而由于Foxp3表达在细胞内，需要经过固定、破膜等一系列步骤后方可对其进行染色、检测，这在很大程度上有可能对结果的重复性、准确性造成干扰，所以用 CD4、CD25和 Foxp3联合标记调节性T细胞的可行性较差。有文献报道CD127在非调节性T细胞高表达而在调节性T细胞表面是低表达的，通过CD4+CD25highCD127lowTreg选定的细胞与表达FOXP3的调节性T细胞数量相近，并且CD4+CD25highCD127lowTreg细胞的特性与CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞是一致的[5]，因此本文用CD127联合CD4、CD25检测Treg细胞, 具有代表CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞表达水平的作用，同时可以保持细胞的完整性和结果的可重复性。CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞是抑制体内炎症反应、维持自身免疫耐受的重要细胞,CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞细胞通过抑制炎症因子的释放减少中性粒细胞的活化并减轻效应记忆T细胞对血管壁的破坏[12]。有研究发现相对于健康者，AAV患者CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞虽然数量是增加的，但其抑制炎症反应的功能下降[13]，有研究发现，AAV患者外周血活性Treg细胞表达下降[11]，本文发现，与缓解组及健康对照组比较，活跃组外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+细胞的百分比下降，且其表达量与患者BVAS评分负相关，推测下降的CD4+CD25highCD127lowTreg细胞不能抑制体内炎症反应，从而加重血管炎的活跃度。

AAV患者的肾损伤临床表现轻重不一、肾病进展也有快有慢，其临床表现的多样性可能与其病理损伤类型的多样化有关，研究发现病理损伤类型有助于指导临床治疗并预测肾脏结局[2]。肾功能最好的是局灶性病变，最差的是硬化性病变[14]，但MPA不同病理类型的发生发展机制不清楚。本文入选的MPA患者有53.3%的患者行肾穿刺病理检查，50%的肾穿刺患者表现为局灶性，新月体性和混合性的占比分别为20.8%和29.2%，局灶性和混合性组的患者BVAS评分相对于新月体性组均有下降，与此相对应的是，新月体性组外周血mDC占淋巴细胞的百分比和CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+细胞百分比均局灶性组、混合性组下降，而局灶性组与混合性组比较，其外周血mDC和CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占比水平无差异，该结果提示mDC和CD4+CD25highCD127lowTreg细胞数下降可能参与了肾组织的急性病理损伤。

综上，本文发现MPA患者外周血mDC和CD4+CD25highCD127lowTreg细胞下降与疾病活跃度及肾组织急性病理损伤有关。由于入选患者样本量较少，下一步需要增加样本量进行实验结果的进一步验证，同时mDC细胞与CD4+CD25highCD127lowTreg细胞相互作用导致MPA病变进展的机制有待研究。