肝肺综合征大鼠模型肺组织巨噬细胞表型变化

李旭炯，张慧英 *，陈云霞，田小霞，来丽娜

长治医学院1.生理学教研室，2.病理生理学教研室，3.微生物学教研室，4.药理学教研室，山西 长治 046000

巨噬细胞是免疫系统的主要细胞成分，具有较强的异质性，在体内外不同的微环境影响下，可呈现出不同的功能表型，分泌不同的活性分子[1]。目前研究表明，在肝疾病特别是肝硬化发生时，肠道菌群紊乱，肠粘膜屏障及Kupffer细胞功能障碍，门体分流等因素致使大量细菌和内毒素从肠道吸收入血，这种情况下，由于肺对内毒素的敏感性及解剖特点，巨噬细胞聚集于肺组织并被激活，分泌大量的iNOS、NO、CO及血管内皮生长因子（VEGF）等细胞因子，对肺组织造成损伤的同时，促进肺血管扩张及新生血管，进而导致肝肺综合征（hepatopulmonary syndrome，HPS）。因此研究HPS发病过程中肺组织巨噬细胞表型特点及变化，对HPS的防治具有重要的意义。采用复合因素法复制HPS大鼠模型其病理阶段性变化分明，是理想的动物模型[2]。本研究采用该方法对SD大鼠进行处理，通过测定其肺组织中巨噬细胞表型标志分子及分泌产物，归纳其巨噬细胞表型变化特点，为临床该疾病的防治提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠36只，体重（225±25）g，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 四氯化碳（CCl4）分析纯购于天津市富宇精细化工有限公司；胆固醇购于天津市化学试剂公司；TNF-α、IL-10、iNOS和Arg-1 ELISA试剂盒购于上海科鉴生物科技有限公司；CD68小鼠单克隆抗体（ab955）购 自Abcam 公 司；总RNA提 取 试 剂RNAiso Plus，反转录试剂盒PrimeScript™RT Master Mix，实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）试剂、SYBR®Premix Ex Taq™II等购自TaKaRa公司；CD86及CD206和18SRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组 随机均分18只SD大鼠进入HPS模型4周组、6周组及8周组，采用复合致病因素法[2]进行造模，另18只动物分别被设立为同期正常对照组（Control组，n=6），给予标准饲料。上述各组动物分别于相应时间点禁食过夜后，经腹腔麻醉，于无菌、无内毒素的条件下经腹主动脉采血用于相关生化指标检测，同时摘取肺组织液氮冻存。

1.2.2 HE染色 石蜡包埋肝组织及肺组织，分别制备4μm切片，行HE染色。光学显微镜下观察肝及肺组织形态学改变。

1.2.3 免疫荧光法检测肺组织巨噬细胞 肺组织切片常规脱蜡至水，并行抗原修复。PBS冲洗，BSA封闭30 min，分别滴加一抗CD68（1：400），4℃过夜后加入相应的荧光二抗、室温下孵育1 h、含DAPI封片剂封片、镜检。

1.2.4 RT-qPCR检测巨噬细胞表面标志物CD86及CD206 mRNA表达 提取肝组织总RNA，合成cDNA（反转录条件为37℃15 min，85℃5 s）。以cDNA为模板，Primer Express 2.0和Beacon Designer软件设计引物（序列见表1）。SYBR®Green I荧光染料实时定量PCR法对目的基因进行检测。反应条件：CD86 58℃20 s、CD206 59℃20 s，18SRNA 61℃20 s，72℃1 min，共35个循环。以18SRNA为参照物计算，结果采用2-△△Ct表示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences for quantitative RT-PCR

1.2.5 肺组织匀浆中指标检测 按照说明制备肺组织匀浆，采用Elisa法对肺组织中TNF-α、IL-10、iNOS及Arg-1进行检测。

1.3 统计分析

各数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析。以均数±标准差（）表示。多样本均数之间进行F检验比较，各变量间相互关系采用Pearson相关性分析，P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 肝和肺组织病理变化

HE及VG染色显示模型组大鼠肝脂肪变性，随病程进展纤维增生逐渐加重，至第8周可见明显的假小叶形成（图1A、B）。肺组织HE染色显示，模型组从第4周起即可见肺泡间隔增厚、炎性细胞浸润，第6周可见明显的肺泡间隔增厚，腔内和间隔内巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞积聚，第8周肺泡间隔进一步增厚，部分肺泡腔变小，巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞大量聚集（图2A）。巨噬细胞标志物CD86免疫荧光结果显示：在模型组动物肺组织中，随着病程进展，可见其大量浸润（图2B）。

图1 肝组织病理变化 A：肝组织切片HE染色B：肝组织切片VG染色Fig.1 Pathological changes of liver tissues A:Liver tissuesof HEstaining;B:Liver tissuesof VGstaining

图2 肺组织病理变化 A：肺组织切片HE染色B：免疫荧光检测肺组织中CD68变化（红色）Fig.2 Pathological changes of lung tissues A:Lung tissues of HE staining;B:Pulmonary tissues of immunofluorescence staining for CD68(red)

2.2 肺组织中CD86及CD206 mRNA表达

模型组动物肺组织中CD86 mRNA表达随病程进展逐渐升高（P＜0.05），至第6周达高锋，第8周出现明显回落，但仍明显高于同期正常对照组；CD206 mRNA第4周其表达未见明显变化，在第6周和8周其表达明显高于同期正常对照组（P＜0.05），见图3。

图3 肺组织中CD86和CD206 mRNA表达水平*P＜0.05，与正常对照组比较△P＜0.05，与HPS模型4周组比较#P＜0.05，与HPS模型6周组比较Fig.3 ThemRNA expression levelsof CD86 and CD206 in thelung tissues*P＜0.05 vs normal control group;△P＜0.05 vs 4th week HPSgroup;#P＜0.05 vs 6th week HPSgroup

2.3 肺组织中TNF-α、IL-10、iNOS及Arg-1含量

HPS大鼠肺组织中iNOS和TNF-α水平在各个时间点均显著高于同期正常对照组（P＜0.05），其中以第6周最高，4周组次之；Arg-1和IL-10的水平在第4周未见明显变化，在第6和第8周可见明显升高（P＜0.05），见表2。

表2 肺组织中iNOS、Arg-1、IL-10及TNF-α水平（,n=6）Tab.2 Contents of iNOS，Arg-1，IL-10 and TNF-αin the lung tissues（Mean±SD,n=6）

表2 肺组织中iNOS、Arg-1、IL-10及TNF-α水平（,n=6）Tab.2 Contents of iNOS，Arg-1，IL-10 and TNF-αin the lung tissues（Mean±SD,n=6）

注：*P＜0.05，与正常对照组比较△P＜0.05，与HPS模型4周组比较#P＜0.05，与HPS模型6周组比较Note:*P＜0.05 vsnormal control;△P＜0.05 vs4th week HPSgroup;#P＜0.05 vs6th week HPSgroup

2.4 相关性分析

模型组动物肺组织iNOS与CD86表达呈显著正相关（r=0.903，P＜0.01）；Arg-1与CD206表达呈显著正相关（r=0.871，P＜0.01）；IL-10与CD206基因表达（r=0.769，P＜0.05）呈显著正相关。

3 讨论

巨噬细胞在不同的微环境可呈现出不同的表型。按照功能，一般把以分泌促炎因子为主，发挥促炎功能的巨噬细胞称为M1型巨噬细胞，其常见的表面标志分子是CD86；而以降低炎症反应，修复组织为

主的巨噬细胞称为M2型巨噬细胞，其常见的表面标志分子是CD206[3]。在M1/M2极化中出现的失衡可能具有有害影响，可导致疾病或炎症状态[4]。

本研究中，根据肝及肺组织形态学的改变，表明HPS大鼠模型复制成功；并且在HPS发病过程中，聚集于肺组织的巨噬细胞呈现出一定规律表型变化特点：在HPS发病初期（第4周），M1明显增加，表明炎症反应是这一时期的主要特点。既往研究表明：为抵消过度的炎症，巨噬细胞可将其表型转化成M2型，以保护宿主免受极端伤害并触发伤口愈合。随着病程进展，炎性反应逐渐加强，至第6周达到高峰，M2开始明显增加，表明在这一时期开始出现明显的抗炎及组织修复反应。之后炎症反应开始降低，到第8周则主要表现为抗炎及组织修复反应，从第4周到第8周，M2/M1比值逐渐增加。但这一变化特点并不意味着病变减轻，相反不恰当的抗炎及修复反应常导致疾病加重，例如在纤维化和癌症等慢性疾病中常常可以观察到M2巨噬细胞的主导作用及高反应性[1]。

氨基酸代谢与巨噬细胞功能表型密切相关。iNOS及Arg1是精氨酸代谢中两个重要的酶。iNOS主要由M1巨噬细胞分泌。本研究发现iNOS与M1标志分子CD86具有一致的表达趋势，并在第6周达到高峰。iNOS可以通过分解L-精氨酸产生NO及ROS促使组织发生炎性损伤，而过量的NO是导致HPS患者肺血管异常扩张的主要原因。与之相对，M2巨噬细胞表达高水平的Arg1。Arg1可与iNOS竞争结合L-精氨酸，拮抗M1的炎性反应。Arg1通过精氨酸代谢途径产生大量的L-鸟氨酸和多胺，在组织修复中发挥重要的作用[5]。本研究发现肺组织Arg1从第6周开始明显增加，这一结果与上述模型肺组织中巨噬细胞表型变化特点是吻合的。

巨噬细胞表型的极化依赖于其微环境中的刺激物。在LPS、TNF-α等炎性介质的作用下巨噬细胞可极化为M1型。本研究结果显示HPS大鼠的肺组织中TNF-α含量随着病程进展逐渐增加，于第6周开始明显高于正常对照组。这与第6周M1型巨噬细胞标志分子CD86高度表达是一致的。但第8周，TNF-α与CD86呈现不一致的表达，CD86较第6周明显降低，而TNF-α变化并不明显。产生这种现象的原因很可能与M2巨噬细胞具有抑制M1巨噬细胞的作用及M2b亚型巨噬细胞对TNF-α的分泌有关[6,7]。对于M2巨噬细胞极化，主要由IL-4、IL-10等细胞因子所介导，本研究发现肺组织IL-10含量从第6周开始明显增加，这与从第6周开始M2型巨噬细胞明显增多是相一致。IL-10在推动和增强M2极化的同时，M2型巨噬细胞也分泌IL-10，在几种内源性因子如TNF-α和它自身的刺激下，IL-10的表达明显增加[8,9]。本研究中，第8周IL-10含量继续增加可能与此有关，进一步表明该时期肺组织反应以修复为主。

综上所述，在HPS的发病过程中，巨噬细胞经历了一系列的表型变化，并发挥不同作用。未来对HPS肺组织巨噬细胞极化及其在发病中所起作用及机制的深入研究，将会对临床防治HPS产生积极影响。