外周血中淋巴细胞亚群表达水平对诊断骨关节炎的临床应用价值

陈 凯，朱玲玲,肖韩艳,庞丽莹,李梦雨,关会林，金 红

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院,黑龙江 牡丹江 157011)

OA是骨退行性疾病之一。患者常伴有压痛、 僵硬、步行障碍等症状，严重影响人们的生活质量,国内外调査发现OA好发于60～79岁的女性人群 中[1-2]。OA主要累及关节软骨，在多因素的作用下导致关节软骨破坏。有研究表明，导致骨关节炎的 发生免疫因素起到了很大的作用[3]。在OA滑膜组 织中存在巨噬细胞、T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细 胞(CD3+、CD19+即 CD19+细胞)、NK 细胞(CD3+、 CD56+即CD56+细胞)等免疫细胞。T淋巴细胞包 括辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+、CD4+,即CD4+细 胞)、抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+、CD8+,即 CD8+细胞)，这些细胞在机体适应性免疫环节中发 挥重要作用。淋巴细胞亚群包括CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD56+。在疾病微环境状态改变下， 被激活的淋巴细胞产生大量细胞因子和炎症介 质[4]。目前，国内外对淋巴细胞亚群在OA患者外 周血中表达水平少见报道。本研究旨在探讨淋巴细 胞亚群在OA患者外周血中的水平变化，从而探讨 其是否可作为OA的诊断指标。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集于2020年12月至2021年10月 期间经牡丹江医学院附属红旗医院诊断为骨关节炎 并且符合入选标准的30例患者作为实验组,同时选 取同期30例健康体检者作为对照组。

实验组的纳入标准:诊断标准符合2018版中华 医学会颁布的《骨关节炎诊疗指南》；(2)年龄40～ 80岁。实验组排除标准：(1)排除患有类风湿关节 炎(RA)、具有其他骨关节系统疾病病史的患者和近 期曾接受临床过治疗的患者；(2)存在影响流式细 胞仪计数的炎症性疾病;(3)长期服用激素类药物 的患者、糖尿病和患有肿瘤疾病患者；(4)血沉、类 风湿因子以及抗O升高患者；(5)使用过免疫抑制 剂及生物抑制剂的患者。

本研究通过了牡丹江医学院附属红旗医院伦理 委员会批准审查，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 采用美国贝克曼库尔特流式 细胞仪FC 500,试剂采用美国贝克曼库尔特流式细 胞仪的配套试剂，检测淋巴细胞亚群表达水平。采 用德国西门子BNII全自动蛋白分析仪，试剂采用全自动蛋白分析仪的配套试剂，检测类风湿因子(rheumatoid fator,RF)、C反应蛋白(c-reactive protein,CRP)、抗环瓜氨酸肽抗体(anti cyclic citrullinated peptide antibody,CCP)的表达水平。

1.2.2 收集血液样本 在空腹状态下采集患者静脉血液5 mL至含有乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝剂的真空采血管中，用于检测淋巴细胞亚群表达水平。同时收集患者静脉血液3～5 mL至含有惰性分离胶、促凝剂的真空采血管中，充分混匀后,1 000×g离心10 min,收集上层血清置于-80 ℃冰箱冻存待检，用于检测RF、CRP、CCP的表达水平。

1.2.3 全血中淋巴细胞亚群测定 取流式管，编号为Tn(CD3+、CD4+、CD8+)、Bn(CD19+、CD56+)。在T管和B管中分别加入相应的荧光标记的抗体。每管加50 μL EDTA-K2抗凝全血，将试管在旋涡混合器上混匀10～20 s,室温避光静止25 min。每管加 裂红素250 μL,混匀，室温避光静止20 min。每管加入2 mL PBS,混匀，1 500×g离心5 min。留下细胞沉淀,弃去上清，每管加入250 μL PBS混匀,上流式细胞仪检测。

1.2.4 血清中RF、CRP、CCP测定 将在-80 ℃冰箱冻存待检的血清放置于室温完全融化，上BNII全自动蛋白分析仪检测。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0分析并生成受试 者工作特征曲线(ROC曲线)，计量资料以“均数±标准差”表示;两组间比较采用两个独立样本t检验;采用ROC曲线分析诊断效能，以约登指数最大值确定最佳诊断界限值；以P<0.05,差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组与对照组的基本资料本研究的实验组与对照组性别、年龄均无明显差异(均P>0.05)。实验组血清中CCP表达水平高于对照组(均P<0.05)。RF、CRP在实验组与对照组之间无统计学意义(均P>0.05),见表1。

2.2 全血中淋巴细胞亚群的表达水平在实验组全血中CD4+表达水平远低于对照组(P<0.05),而CD8+表达水平远高于对照组(P<0.05)。CD3+、CD56+及CD19+在实验组与对照组之间均无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 实验组与对照组淋巴细胞亚群表达情况

2.3 CD4+与CD8+对OA的诊断价值根据CD4+与CD8+在实验组与对照组的表达水平分别做ROC曲线,并通过Logistic建立CD4+、CD8+联合诊断模型并绘制ROC曲线。发现CD4+、CD8+联合诊断OA的AUC以及特异度要高于两种指标单独检测。但CD8+单独检测的灵敏度要高于其联合检测。见表3,图1。

表3 CD4+、CD8+单独检测及联合检测的诊断效能

图1 CD4+、CD8+单独检测及联合检测的ROC曲线

3 讨论

OA主要以进行性疼痛、行走困难为特征，最终导致关节变形[5-6]。尽管人们对OA的认识越来越深入，但发病机制仍不清楚。CRP是一种非糖基化蛋白，可评估机体炎症反应强度的指标[7]。Y-VONNE C.LEE等人[8]，在对OA患者的基线指标进行分析时发现,OA患者的CRP要高于对照组的表达水平(P<0.05)并有研究发现，其表达水平与Kellgren & Lawrence分级有关,KL3级和KL4级的患者CRP的表达水平要明显高于KL2级的患者[9]。但在本研究中，得出CRP在实验组与对照组之间无差异(P>0.05)的结论,这可能是患者自身未出现滑膜炎症或者标本量不足所导致。值得思考是,CCP是诊断类风湿关节炎较特异的一项指标,Dres Damgaard等人[10]，在一项研究中证明CCP在类风湿关节炎组表达水平要高于骨关节炎组且差异有统计学意义(P<0.05)。但在国内外未见文献报道CCP在OA与健康成人组是否有差异。本研究 中发现,CCP在OA与健康成人组表达水平有统计学意义(P<0.05)，但OA组的CCP的数值都在参考值范围之内。CCP能否做为OA的一个潜在的风险因素，还需要今后更加深入的研究。

研究表明，OA的发生发展与慢性炎症的持续 性刺激有关[11]。在OA的发病机制中激活免疫反 应的诱发因素包括炎症与创伤之间的相互作用[12]。 淋巴细胞属于免疫细胞,参与机体的免疫反应，它包 括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞。T淋巴细胞 占淋巴细胞的大多数，主要分为两个亚群:辅助/诱 导T淋巴细胞(CD3+CD4+,即CD4+细胞)、抑制/细 胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+,即CD8+细胞)。CD4+细胞在免疫反应中起核心作用,又分为五个主要细 胞亚群:Th1、Th2、Th17、Treg 和 Tfh。Th1 可以表达 CXCR3,它在Th1细胞向炎症部位迁移过程中起重 要作用。CD4+细胞还能在接受病原体刺激后分化 出效应细胞，效应细胞会分泌出干扰素、白介素等细 胞因子和其他免疫调节因子，从而参与机体的炎症 反应，因此CD4+细胞对人体的免疫功能有非常重要 的作用。CD8+细胞是一种监控并在需要时杀死靶 细胞的细胞,一旦发现带有特异性抗原的靶细胞,会 刺激效应细胞产生细胞毒作用去消灭被感染的细胞 或癌细胞。Jeng-Long Hsieh等[13]，发现 CD8+细胞在小鼠滑膜液中持续增殖。并通过实验证实， CD8+细胞在自身免疫性疾病发挥其重要作用,该细 胞的活化、分化和发育可受到多种炎性细胞因子、转 录因子和趋化因子的影响[14]。在一项研究中，终末 期OA患者的滑液和外周血中CD4+细胞对激活Th1 细胞的极化增加并促进了细胞因子的分泌导致疾病加重，最终使疾病进程永久化[15]。不同的是，在本 研究有30例OA的患者入组,在实验组与对照组相 比CD4+细胞明显降低,CD8+细胞明显升高，差异均 有统计学意义。这可能是机体的免疫调节机制发挥 作用，对机体产生了积极的作用，有利于机体的修 复。在本研究中,CD19+、CD56+这两个指标实验组 与对照组之间并未有统计学意义，这也有可能受到 标本量的局限所导致。也有可能该患者未处于疾病 的一个急性期所导致相应指标并未升高,这需要今 后扩大样本量以及将处于不同时期的患者进行分组 比较加以证实。CD4+、CD8+实验组与对照组之间是 有统计学意义的(P<0.05),并且通过Logistic建立 CD4+、CD8+联合检测OA的模型发现，联合检测比 单独检测OA的曲线下面积要大。同时也发现 CD8+单独检测的灵敏度要高于其联合检测的灵敏 度，但在检测结果中一项指标的灵敏度过高的话，其 发生假阳性的几率也会增加。

综上所述,OA的发病机制与免疫反应有着广 泛的联系，淋巴细胞亚群可以反应机体免疫功能。 CD4+、CD8+联合检测是诊断OA的较好的方法。同 时CD4+、CD8+的表达水平可作为观察OA的治疗、 疗效监测的一个重要指标,为明确OA的发病机制 提供新思路。