基于网络药理学探讨玉女煎治疗糖尿病作用机制

开伟华,戴 晨,查 诚,陈 建

(1.铜陵职业技术学院;2.安徽安科恒益药业有限公司,安徽 铜陵 244061)

糖尿病是一种慢性疾病,其并发症具有较强的隐匿性,早期极易被忽略,待病症显露可以影响到全身的各个器官,往往会导致糖尿病患者失明和残疾,甚至危及生命。中医认为,糖尿病多为燥热阴虚,津液不足,以滋阴清热,补肾益精为治。玉女煎一方出自《景岳全书》,由石膏、熟地黄、麦冬、知母、牛膝诸药组成,方中石膏辛甘大寒,清胃火;熟地黄甘而微温,滋肾水;知母苦寒质润、滋清兼备;麦冬微苦甘寒;牛膝补肝肾,降上炎之火,止上溢之血。本方以状如“玉女”之石膏为主,宛若观音大士用柳枝蘸净瓶之水洒于大地,平息阴虚火亢之症,故名“玉女煎”,在糖尿病治疗中具有清胃泻火,滋阴增液之功[1]。

网络药理学整合了系统生物学、多项药理学、强调对信号通路的多成分、多靶点、多途径调节作用综合分析,系统观察药物对疾病网络的干预与影响[2-3]。本文采用网络药理学方法探讨玉女煎治疗糖尿病的生物学机制,为玉女煎治疗糖尿病实验研究奠定了基础。

1 资料与方法

1.1 玉女燕各中药活性成分及靶点收集为收集玉女煎中5种药材的化合物成分,利用TCMSP数据库以玉女煎全方“石膏”“熟地黄”“麦冬”“知母”“牛膝”为关键词,以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)N30%,类药性(Drug like property,DL)N0.18为参数筛选,收集玉女煎的有效化学成分信 息。并利用TCMID数据库对TCMSP数据库中未收 录的中药的活性成分进行补充。

用Pubchem数据库获取各活性成分的SMILES号,导入Swiss数据库预测各成分对应的靶点,再统一经过UniProt蛋白数据库(https://www.uniprot.org/)进行对照规范,来源物种校正为“humon”,获取作用靶点的标准名[4]。

1.2 糖尿病靶点的筛选分别在TTD数据库、Gene Cards数据库和DrugBank数据库中以“diabetes”为关键词检索与糖尿病相关的靶点,每个数据库取前300个靶点组建糖尿病相关靶点数据库[1],合并去重,筛选处理后获取疾病的作用靶点[5]。

1.3 药物-成分-疾病-靶点的网络构建为阐明玉女煎活性成分与糖尿病相关靶点间的相互关系,将筛选过的玉女煎活性成分与糖尿病靶点上传至在线韦恩图绘制网站绘制韦恩图,获取药物与疾病共同靶点。采用Cytoscape 3.7.2软件绘制药物-成分-疾病-靶点网络图。

1.4 靶点相互作用关系为明确玉女煎对糖尿病靶点之间的相互作用,利用String 11.0网络平台对共同靶点构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI),其中蛋白种类设置“Homo sapiens",阈值设为中等置信度>0.4,其余参数默认设置不变。这些网络由“节点(node)”与“边(edge)”组成,节点代表靶点,边表示分子间的相互作用,即节点之间的链接[6]。

1.5 GO功能分析和KEGG信号通珞富集分析将玉女煎和糖尿病获取共同靶点导入David 6.8数据库进行GO富集和KEGG富集分析,利用GraphPad Prism 7.0绘制GO富集柱状图,并分别展示玉女煎治疗糖尿病最可能涉及的生物学过程(biological process,BP)、分子生物学功能(molecular function,MF)和细胞组分(cellular component,CC),利用OmicShare云平台绘制KEGG气泡图。

1.6 分子对接使用Autodock Vina 1.1.2软件进行对接,在Mgtool工具中准备蛋白质和配体,在RCSB PDB数据库中下载各靶点晶体结构,运用Pubchem数据库下载各成分3D结构的SDF格式,以靶点小分子配体为活性中心,对数据库进行再对接,探讨化学成分与靶点之间结合,用Auto工具计算对接结合能,Pytool工具绘制靶点蛋白与分子的对接图。

2 结果

2.1 中药活牲成分和靶点筛选本研究通过对玉 女煎活性成分进行检索,5味中药去重筛选出活性成分257个(生石膏1个,熟地黄15个,麦冬55个,知母154个,牛膝41个,见图1)。

图1 玉女煎中药各活性成分数量

收集各成分对应靶点,选择Swiss数据库收录且匹配程度高的基因名称作为目标成分的重要靶点,去除无靶点的孤立成分,共收集活性成分133个,对应成分共有靶点6 713个靶点(知母活性成分71个,对应靶点3 263个;熟地黄活性成分14个,对应靶点345个;牛膝活性成分28个,对应靶点1 981个,麦冬活性成分29个,对应成分靶点169 4个;生石膏主要成分CaSO4,无对应靶点,见图2),以上靶点去重后共有982个。

图2 中药各活性成分-靶点数量图

2.2 疾病-靶点的确定检索与糖尿病相关靶点,GeneCards数据库中获得14 950个,TTD数据库中获得225个,DrugBank数据库中获得2个,根据相关度每个数据库取前300个靶点组建糖尿病相关靶点数据库,三个数据库合并去重共得疾病靶点495个。

2.3 中药-成分-疾病-靶点网络图构建将中药靶点982个与疾病靶点495个,经Venny 2.1.0映射后得到134个共同靶点(见图3),输入Cytoscape 3.7.2软件构建中药-成分-疾病-靶点网络图(见图4),对网络图进行分析显示,degree值排名前四的关键靶点蛋白为11β-HSD1、PTPN1、AD0RA1、SHBG,分别为40、38、38、35；degree值排名前五的活性成分为环(酪氨酸-亮氨酸)二肽[cyclo(Tyr-Leu)]、橙黄胡椒酰胺(aurantiamide)、金色酰胺醇酯(aurantiamide acetate)、异裁莫皂忒(smilagenin)、菠藝皂昔兀(sarsasapogenin),degree值分别为35、27、26、26、26。表明在玉女煎治疗糖尿病中,这些连接靶点较多的活性成分可能具有重要作用。

图3 中药-疾病共同靶点韦恩图

图4 中药-活性成分-疾病-靶点网络图

2.4 中药-疾病靶点PPI网络构建将134个共同靶点导入String网络平台进行蛋白互作分析,构建 PPI网路图(见图5),图中共有134个节点,1 493条 边,平均节点度为22.4,网络节点代表靶点,线条代 表靶点与靶点之间的相互作用。

图5 中药-疾病共同靶点PPI网络图

2.5 GO功能富集分析结果对玉女煎治疗糖尿病134个靶点进行GO功能富集分析,计算出BP、MF 和CC各有460、102、46条,P代表富集的显著性,P越小显著性越高,取前20条绘图,结果如图6所示。 其中BP主要涉及细胞增殖的正调控、凋亡过程的负调控、炎症反应、基因表达正调控、蛋白质磷酸化的正调控等,MF主要涉及类固醇激素受体活性、蛋白酪氨酸激酶活性、RNA聚合酶II转录因子活性、ATP结合等,CC主要涉及质膜、质膜的组成部分、膜筏、细胞表面等。

图6 玉女煎-糖尿病GO富集分析

2.6 KEGG通路富集分析结果对玉女煎治疗糖 尿病134个靶点进行KEGG通路富集分析,取排名 前20条通路,结果见图7,P代表富集的显著性。富 集程度高且富集基因数较多通路主要为:HIF-1信 号通路、恰加斯病、神经活性配体-受体相互作用、 胰岛素抵抗、癌症的途径、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、VEGF信号通路、破骨细胞分化、FoxO 信号通路等。表明玉女煎对活性成分可能作用于这 些信号通路来达到治疗糖尿病的目的。

图7 玉女煎-糖尿病KEGG富集分析

2.7 中药主奏活性成分和核心靶点分子对接取中药-成分-疾病-靶点网络中degree值≥25中药主要活性成分cyclo(Tyr-Leu)、aurantiamide、aurantiamide acetate A smilageninA sarsasapogenin,degree值≥35的关键靶点11β-HSD1、PTPN1、ADORA1、SH-BG。将成分与靶点进行分子对接,结合形成稳定构象时能量越低,结构越稳定越契合,越能发挥药效,对接结果见表1和图8,如靶点HSD11B1与aurantiamide acetateA sarsasapogeninA smilagenin的对接结合能分别为-9.6 KJ/mol、-12.2 KJ/mol、-11.9 KJ/mol,靶点AD0RA1与sarsasapogenin、smilagenin 的结合能为-10.7 KJ/mol、-10.8 KJ/mol。因此,主要活性成分与核心靶点的结合情况与预测关系相符。

图8 分子对接模式图

表1 玉女煎有效活性成分-关键靶点分子对接结合能比较(KJ/mol)

3 讨论

玉女煎治疗以清胃热,滋肾阴为主。本研究采用网络药理学构建玉女煎中“疾病-基因-靶标-药物”的互作网络,研究通过结合生物信息学对玉女煎治疗糖尿病成分、靶点匹配和分子对接,发现玉女煎的主要活性成分smilagenin、sarsasapogenin,具有抗糖尿病、抗氧化、抗癌、抗炎等多种功效。主要靶点11β-HSD1是糖皮质激素的代谢酶,11β-HSD1抑制剂能减少糖皮质激素的生成及活化,提高脂肪组织、肝脏和骨骼肌胰岛素的敏感性,影响机体内的糖脂代谢[7-8]。ADORA1对糖尿病兼抑郁症大鼠的学习记忆能力损伤有正向的保护作用;升高SHBG水平能显著改善胰岛素抵抗水平,改善糖尿病患者肥胖及组织代谢异常情况[9-11]。信号通路中HIF-1α表达增加,可调控下游细胞因子VEGF表达,促进新生血管形成,改善肾脏微循环,减轻肾脏缺氧及缺血。当糖尿病肾病病情不断恶化时,高血糖抑制HIF-1α,损害肾脏作用增加,HIF-1α诱导细胞凋亡作用显现,且血糖升高时红细胞携氧能力减低,缺氧状态明显,VEGF高表达,尿蛋白增多,肾脏将严重受损,疾病加剧进展[12-13]。TLRs参与Ⅱ型糖尿病患者的胰岛素抵抗、B细胞功能障碍及并发症的发展,在II型糖尿病患者体内,TLR2信号通路等水平均显著高于正常人群,并参与炎性反应[14]。

综上所述,通过网络药理学的方法,建立了玉女煎“化合物-靶点-通路-疾病”网络模型,初步预测了玉女煎治疗糖尿病的作用机制,但是其进一步的机制研究还需要通过体内、外实验来加以验证。