芍药不同品种群种质资源表型多样性分析

王慧娟，王二强，符真珠，李艳敏，王晓晖，王占营，袁 欣，高 杰，王利民，张和臣

（1. 河南省农业科学院 园艺研究所，河南 郑州 450002；2. 洛阳农林科学院，河南 洛阳 471023）

芍药（Paeonia lactifloraPall.）属芍药科芍药属，多年生宿根草本，是我国的传统名花，栽培历史悠久。芍药不仅具有风姿绰约的观赏特性，已发展成为世界流行的切花种类，而且其肉质根可入药，其种子可榨油，用途广泛，具有很大的开发潜力。芍药品种繁多，具有一定的地域性，并且近年来国外优良芍药品种不断引进，其亲本来源丰富，遗传背景更为复杂[1]，极大地丰富了我国芍药育种资源的多样性。

表型性状是植物多样性最直观的反映，表型分析是研究物种变异和进化的传统方法，是衡量物种多样性的重要指标和主要研究内容，通过多样性指数、相关性、主成分及聚类分析对种质资源表型性状遗传多样性进行鉴定分析已被广泛应用于农作物、林木等种质分类及评价[2-6]。利用表型性状对不同品种群芍药种质资源进行遗传多样性分析，对于种质资源的高效利用和种质创新具有重要意义。关于芍药种质资源表型多样性研究，前人多针对国内传统种植的中国芍药品种群品种，或仅针对花色等单一表型进行多样性研究。如刘春迎等[7]选取了56 个表型性状对60 个芍药栽培品种进行数量聚类，分析得出花型是芍药品种分类的重要标准；万映伶等[8]对菏泽市和洛阳市栽培的240 个芍药品种进行多样性分析并明确了影响芍药表型的主要因子；郭先锋等[9]运用聚类分析揭示出27 个芍药栽培品种与5 个野生种芍药关系最近；王荣等[10]、刘苏闽等[11]则主要针对扬州芍药品种进行多样性研究，通过聚类结果可以看出，扬州芍药品种的多样性与芍药株高有较大的相关性，筛选了针对不同育种目标的品种群；王玉蛟等[12]、吴芳芳等[13]基于花色单一表型对芍药种质资源的表型多样性进行了数量分类研究。仅有杨柳慧等[14]对不同品种群的47 个芍药品种的33个表型性状进行了多样性分析，认为国内品种与大多数国外品种的亲缘关系较远。针对不同来源、不同品种群的芍药种质资源表型性状多样性还有待于深入研究。鉴于此，以109 份不同品种群的芍药种质资源为研究对象，通过对其38个表型性状进行变异、相关、主成分及聚类等多样性分析，揭示表型变异特点，为充分挖掘和利用芍药种质资源及新品种培育提供参考和依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料包括109 份国内外芍药种质资源，其中中国芍药品种群（Lactiflora group，LG）97 个（其中，国内传统种植品种82 个，国外引进品种15 个），杂种芍药品种群（Hybrid group，HG）9 个，伊藤芍药品种群（Iton group，IG）3 个，HG 和IG 均为国外引种。试验材料均为3 年生分株苗，栽植于河南现代农业研究开发基地芍药资源圃中，株行距50 cm×100 cm。具体品种信息见表1。

表1 109份芍药种质资源Tab.1 109 herbaceous peony germplasm resources

1.2 表型性状观测

表型性状于2020—2021年重复观测。根据《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南芍药》（NY/T 2225—2012）[15]选取了38 个具有代表性且遗传相对稳定的表型性状，其中数量多态性状4个、定性多态性状27 个、二元性状7 个。每个品种随机选择6株进行指标测定，测定时期为2月下旬至5月上旬，株高、复叶顶小叶长宽比值、茎粗、花径等数量性状用卷尺和游标卡尺测量，叶片颜色、茎秆颜色和花色等质量性状直接观测定性，花期以50%达到盛花期为准。采用等级数量编码方法进行处理，表型性状及其赋值规则见表2。

表2 芍药表型性状及其测量方法和赋值规则Tab.2 Phenotypic traits of peony and measurement method and assignment rules

表2 芍药表型性状及其测量方法和赋值规则Tab.2 Phenotypic traits of peony and measurement method and assignment rules

1.3 数据分析

通过Excel软件结合SPSS 22.0分析软件进行数据处理及分析。质量性状：计算其各级分布频率的有效百分比。数量性状：计算一般的描述性统计数据，包括全距、极值、均值、变异系数和标准差，并参照孙珍珠等[16]的方法划分等级，然后从第1 级［Xi＞（xˉ+2δ）］到第10 级［Xi＜（xˉ-2δ）］，每0.5δ 为1 级，计算各个级别数目及分布频率。Shannon-Wiener遗传多样性指数（H＇）表示各表型性状的多样性程度，H＇=-Σ（Pi×lnPi），式中Pi为某性状第i分级内材料分布频率的有效百分比。

利用SPSS 22.0分析软件，通过方差齐性检验整体变异分布情况，对表型性状进行Pearson相关性分析，根据平方欧式距离按照Ward法对性状进行R型聚类分析；运用主成分分析，提取对芍药种质资源分类贡献较大的性状；最后采用R 语言对品种进行层次聚类分析及可视化作图。

2 结果与分析

2.1 芍药数量性状变异及多样性

数量性状的变异程度通过极差、极小值、极大值、均值、变异系数和标准差等反映。表型性状丰富程度与变异系数大小呈正相关[17]。由表3 可知，4个数量性状中变异系数平均值17.59%，其中株高的变异系数最大（24.71%），具有丰富的多态性；茎粗的变异系数（18.12%）次之；而顶小叶长宽比值和花径的变异系数较小，只有14.45%和13.08%，说明其变异幅度较小，遗传特性较为稳定。数量性状遗传多样性指数分布在1.83～2.10，平均值为2.00，其中株高、花径、茎粗3个性状的多样性指数均在2.00以上，表明这些性状在每一级中的分布比较均匀。

表3 芍药种质资源数量性状多样性Tab.3 Diversity of quantitative traits of peony germplasm resources

2.2 质量性状变异分布频率及多样性

对109 个芍药品种34 个质量性状进行多样性分析（图1，表4）。结果表明，供试芍药以紧凑（34.86%）和半开张（33.03%）为主。茎色以绿色（78.90%）为主。芽丛颜色以紫红色（77.06%）为主。75.23%叶缘具有锯齿。花色以粉色（25.69%）和紫红色（31.19%）为主，白色（11.93%）和复色（10.09%）次之，其他花色占比很少，均少于10%。花型以台阁花型（47.71%）为主，托桂型（19.27%）次之，单瓣型（8.26%）、皇冠型（6.42%）、绣球型（5.5%）较少，其他花型占比只有1%～3%。花期以中花（65.14%）为主，早花（17.43%）和晚花（16.51%）次之，极早花期（0.92%）极少。雄蕊正常（39.45%）和部分瓣化（21.1%）占多数，可作为杂交父本。雌蕊正常（52.29%）超过半数，可作为杂交母本。在生长势方面，62.38%生长势较强，在资源圃生长良好。

图1 芍药种质资源质量性状变异分布频率Fig.1 The variation distribution of qualitative traits of peony germplasm resources

34 个质量性状的遗传多样性指数介于0.28～1.82（表4），平均值1.06，低于数量性状。多样性指数较高（H＇＞1.20）的性状有株型、花色、花型、花香、心皮数、心皮被毛、柱头颜色，表明这些性状指标在不同描述类型中分布较均衡。侧蕾多少、叶质、蕾形、雄蕊状态、心皮被毛、结实性、叶色等性状的多样性指数在1.00～1.20。茎被毛、蕾绽口、叶脉凹陷、花瓣有无杂色等性状的多样性指数＜0.50，表明供试芍药品种在这4个性状的表现型分布很不均衡。多样性指数分析结果表明，供试材料花朵、株型及叶片具有丰富的遗传多样性。

表4 芍药种质资源质量性状的多样性Tab.4 Diversity of qualitative traits of herbaceous peony germplasm resources

2.3 性状相关性分析及R型聚类结果

对芍药种质资源的表型性状进行相关性分析（图2），结果表明，38个表型性状中部分性状之间存在不同程度的相关性，其中性状间呈极显著相关性的有67 对，显著相关的有53 对。其中株高与茎粗（相关系数0.512）、顶小叶形状与长宽比值（0.400）、株型与茎态（0.544）、茎态与花态（0.497）、花型与株高（0.387）、花色与花瓣有无杂色（0.310）等表型性状间存在极显著的相关性。从图2 还可以看出，花部各表型性状与其他性状之间存在复杂的相关性，如侧蕾多少与株高、茎粗、顶小叶是否有裂、叶缘锯齿、花型、生长势之间具有显著的相关性，这些性状多数为中国芍药品种群的共同特性；花型与株高、叶缘锯齿、花态、花色、花期、雌蕊状态等性状显著相关；花色与花瓣有无杂色、花态、雌蕊状态、柱头大小等性状极显著相关；并且雌蕊、心皮、柱头等生殖器官相关性状之间互相存在显著相关性。茎、叶部的表型性状与其他性状存在较少的极显著相关性，例如茎色只与茎粗、叶质只与叶片光泽等具有极显著相关性，叶色、叶脉凹陷与其他性状之间不存在极显著相关性。

图2 芍药种质资源表型性状Pearson相关性分析Fig.2 Pearson correlation analysis of phenotypic traits of peony germplasm resources

根据平方欧式距离按照Ward 法进行R 型聚类（图3）。当选取的标尺为15 时，38 个表型性状被划分为4 类，第Ⅰ类11 个性状主要包括株型、茎态、花态、叶态、芽形、蕾形等与植株形态相关以及茎色、瓣端缺刻等性状。第Ⅱ类14 个性状，主要包含花型、花期、雄蕊等花部7 个性状及叶缘锯齿、叶色等叶部7 个性状。第Ⅱ类7 个性状，包括了与颜色相关的芽丛颜色、花色、柱头颜色等性状及雌蕊相关的多数性状。第Ⅳ类6 个性状，包含了株高、茎粗、花径3 个数量性状以及茎被毛、叶面凹陷等植株表面相关性状。R型聚类结果能够一定程度上反映植株、花部及叶部性状间的相关性。

图3 芍药种质资源38个表型性状R型聚类结果Fig.3 R cluster tree diagram of 38 phenotypic traits of peony germplasm resources

2.4 主成分分析结果

从相关性分析来看，部分性状间的相关系数较高，因此有必要通过主成分分析，判断各个性状在反映种质资源多样性方面的重要性大小，从而突显重要性状，提高品种划分的科学性。参照因子分析的标准[18]进行主成分必要性检验，KMO 统计量0.557＞0.5，偏相关性很弱；Bartlett 球形检验统计量的显著性0.000＜0.01，可做主成分分析。

由主成分分析（表5）结果可知，以特征值＞1 为标准提取14 个主成分，累计贡献率69.905%，表明这14 个主成分可以反映原始因子的大部分遗传多样性信息。对一个变量来说载荷绝对值较大的因子与它的关系更密切，从各因子旋转后的载荷量来看，第1 主成分载荷量较大的有柱头大小、心皮被毛，主要与雌蕊相关；第2主成分载荷量较大的有株高和茎粗，与植株长势状态相关；第3主成分对应载荷量较大的有花期、雄蕊状态等与花器官相关的性状；第4 主成分载荷量较大的为茎态、株型，与植株形态相关；第5～7 主成分中载荷量较大的性状主要有叶脉凹陷、叶色、叶质等叶片相关的性状；第8～11主成分中结实性、蕾形、花色、花香等与花部器官相关的性状起决定作用；第12主成分载荷量较大的性状是芽形；第13 主成分中瓣端缺刻的载荷量较大；第14主成分载荷量较大的有叶缘波状程度、花药残留等性状。综上可以得出，影响芍药品种表型差异的主要性状有株高、株型、柱头大小、花期、茎态、叶脉凹陷、叶色、叶缘波状程度、结实性等。

表5 各主成分的特征值、贡献率及旋转后各因子的载荷矩阵Tab.5 Eigenvalues，contribution rate and rotated component matrix of each principal components

2.5 聚类分析结果

根据表型数据对109个供试芍药种质资源进行层次聚类，从聚类图（图4）可以看出，109 份芍药资源分为4 类。第1 类数量较少，包括锦山红、粉盘红星、紫凤羽等11 份资源，全部为国内传统中国芍药品种，典型的表型特征为植株高度较高，平均株高92.67 cm，花色以紫红色为主；第2 类数量最多，除Kansas 这一个国外引种的中国芍药品种外，其余全部为国内传统中国芍药品种，如胭脂红、红峰、紫霞迎雪、美菊、春晓等共42份资源，表型特点是株型紧凑，植株高度中等，平均株高74.54 cm，花色以粉红色、紫红色和和复色为主；第3 类24 份资源，多数为粉玉奴、粉面桃花、佛光珠影、仙鹤白、巧玲等国内传统种植的中国芍药品种，以及国外引种的3 个品种群品种各1 个，表型特征为茎秆较细，平均株高60.67 cm，花色比较丰富；第4 类32 份资源，涵盖了9个国内传统中国芍药品种及几乎全部国外引种的芍药资源，平均株高45.65 cm，但茎秆较为粗壮，长势强健，株型以半开张为主，叶缘多没有锯齿。由此可以看出，株高、株型、花色等性状与品种聚类的相关性较大，证明所选择的表型性状具有较高的代表性。

图4 109份芍药种质资源聚类结果Fig.4 Cluster dendrogram of 109 peony germplasm resources

3 结论与讨论

我国菏泽、洛阳、扬州等地种植的多为传统中国芍药品种，仅有一个野生种参与品种的形成，且多是通过天然杂交实生选育而来，因此花色、花期、株型等表型性状单一[19]。国外芍药的杂交选育已有百年历史，美国牡丹芍药协会（American Peony Society）登录的芍药品种有5 000 多个，分为中国芍药品种群、杂种芍药品种群和伊藤芍药品种群[20]。近年来随着品种的不断引进，亟待对日益丰富的芍药种质资源进行遗传多样性研究，从而为杂交育种工作提供参考。前人对芍药表型性状的多样性研究多集中于国内传统种植的中国芍药品种，本研究则以不同品种群的109 份芍药资源为研究对象，选择38个表型性状，以更大的品种群体研究分析不同品种群芍药种质资源的遗传多样性，使研究结果与其他学者的相关研究互相补充。

利用Shannon-Wiener 指数表示不同种质资源的遗传多样性，可反映出表型性状分级多少和分布状况，同时包含了多样性的丰富度和均匀度[21]。本研究以该指数反映芍药种质资源表型性状的遗传多样性状况，多样性指数介于0.28～2.10，其中数量性状的多样性指数均值（2.00）高于质量性状多样性指数均值（1.06），直观地反映了表型性状多样性程度。这与前人的研究结果一致[9-10]。

由于芍药表型性状较多，且彼此之间存在较为复杂的相关性，对评价和利用芍药种质资源产生一定的影响，有必要通过主成分分析，通过降维的方式筛选重要表型性状，最大程度代表所有性状并排除由于相关关系对分析结果产生的干扰[22]。本研究表型性状的相关性分析显示，性状间呈极显著相关性的有67 对，显著相关的有53 对，并且花部表型性状与其他性状之间存在复杂的相关性，而茎、叶部的表型性状与其他性状存在较少的极显著相关性。进一步进行主成分分析，提取出14 个主成分，累计贡献率69.905%，能够反映表型性状的大部分信息，筛选出株高、株型、柱头大小、花期、茎态、叶脉凹陷、叶色、叶缘波状程度、结实性等对芍药种质资源表型差异具有较大贡献的表型性状，有利于今后对种质资源进行高效评价和利用。

本研究通过层次聚类研究不同品种群芍药资源的遗传关系和分类。聚类结果显示，第1 类全部为国内种植的传统中国芍药品种，第2 类、第3 类除包含国外引种的中国芍药品种、杂种芍药品种和伊藤芍药品种以外，也全部为传统中国芍药品种，主要以株高、花色等表型性状进行聚类；而几乎全部国外引种的中国芍药品种群、杂种芍药品种群和伊藤芍药品种群品种均隶属第4 类。杂种芍药品种群、伊藤芍药品种群与中国芍药传统品种分属不同的聚类，这说明二者由于起源不同而与传统中国芍药品种群距离较远；国外引种的中国芍药品种群品种与传统中国芍药品种同样来源于P.lactiflora，但是却由于距离较远分属不同的聚类，这可能是基于不同的育种目标长期选择的结果，我国传统中国芍药品种的选育以自然选择为主，以风姿绰约为美，而国外芍药野生资源丰富，进行品种杂交选育已愈百年，且以花姿挺拔为美，经过长期人为选择而造成群体性状的差异。

遗传多样性研究可在形态学、细胞学、生理生化以及DNA 分子等水平上进行[23]，这些方法各有优势及局限性，但同样具有一定的一致性，通过相互验证可以保证结果更加科学可靠，整合多种类型数据进行遗传多样性分析已开始应用于粮食作物、果树、花卉等[24-26]。王淼等[27]、蔡健等[28]研究了基于分子标记和形态学性状的芍药品种聚类分析间的相关性，但仅限于国内传统种植的中国芍药品种，今后仍有待于整合分子生物学、表型等水平进行不同品种群芍药种质资源的遗传多样性研究，以期更加客观地进行评价和利用。