纳米基因载体在植物遗传转化中的应用进展

安义伟，梁慧慧，仲崇佳，孙迪虎，生嘉诚，张 震，李 浩，郭光辉

（1. 河南大学 农学院，河南 开封 475004；2. 河南大学 省部共建作物逆境适应与改良国家重点实验室，河南 开封 475004；3. 河南大学 生命科学学院，河南 开封 475004）

植物基因工程是指将外源遗传物质通过多种方法导入受体植物细胞，并整合到受体基因组中，使之表达并稳定遗传，以改变植物的性状表现。遗传转化是植物基因工程的关键步骤之一，自1984年首次利用农杆菌介导法成功获得转基因烟草以来，植物遗传转化技术迅速发展，并在作物品质改良和产量提升中得到广泛运用[1]。目前，在植物中常用的遗传转化方法包括基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法、超声波介导法、PEG（聚乙二醇）介导法、显微注射法等。这些转化方法均有一定的缺陷，例如：常见的基因枪法转化效率低、导入大片段困难、损伤受体细胞及成本高等[2]；农杆菌介导法转化周期长、宿主局限性明显、外源基因随机整合等；而且，基因枪法和农杆菌介导法一般需要经过漫长的组织培养过程，对于组织培养困难的物种很难进行遗传转化；利用花粉管通道法转化时有花期限制，需精准掌握开花时间，转化操作需要一定的经验，且操作难度大、工作效率低[3]；超声波介导法会对受体材料造成一定损伤，转化效率低，且外源基因插入的随机性高[4]；PEG 介导法常应用于植物原生质体的转化，但很难将转化后的原生质体培养成完整植株，且培养周期长；显微注射法的操作难度大，外源基因表达不稳定。因此，有必要探索新的、更加快捷方便的遗传转化方法应用于植物遗传转化。

20 世纪80 年代末，随着纳米技术的兴起，纳米材料以其特殊的表面效应、小尺寸效应以及良好的生物学特性等优点，被广泛应用于基因工程、药物研发及分子细胞生物学等领域[5]。2007 年，TORNEY 等[6]首次将纳米基因载体应用于植物遗传转化领域，其利用二氧化硅纳米基因载体携带目的基因转化烟草和玉米，成功将目的基因递送到烟草、玉米细胞中，为植物基因工程开辟了新途径。近年来，研究人员先后利用碳纳米管[7]、DNA 纳米结构[8]和金纳米簇[9]开发了不依赖于植物物种的、无需外力辅助的、高效的纳米基因载体介导的外源遗传物质递送系统，实现了GFP（绿色荧光蛋白）、GUS（β-葡萄糖苷酸酶）等报告基因和siRNA（小干扰RNA）等向植物细胞或特定细胞器的转入。目前，纳米基因载体已经成功运用于烟草[6]、玉米[6，10]、拟南芥[11]、洋葱[12]、棉花[13]、牡丹[14]和辣椒[15]等植物的遗传转化。主要阐述了纳米基因载体的特征、分类，综述了无机纳米基因载体、天然高分子纳米基因载体、人工合成高分子纳米基因载体在植物遗传转化中的应用进展，并对纳米基因载体在植物遗传转化领域的应用前景进行了展望。

1 纳米基因载体的特征及分类

纳米材料是指在三维空间尺度中至少有一维处于纳米尺寸或由它们作为基本单元构成的材料，主要包括碳纳米材料、金属纳米材料、金属氧化物纳米材料和聚合物纳米材料[16]。纳米材料因具备小尺寸效应、表面效应、生物兼容性、基本无毒等优势，已成为理想的微观运输载体[17]，在生物分子、营养物质和农药等向植物的精准运输中发挥了重要作用[16]。纳米基因载体是以纳米微粒为基本单位、通过分子自组装方法制备而成的[18]，具有体积小、穿透性强、可生物降解、无免疫原性、可保护外源生物大分子免受降解等优点。对纳米基因载体进行表面修饰或改性后，可将核酸和蛋白质等生物大分子吸附在纳米微粒表面或包埋于内部，形成复合物，实现生物大分子向细胞内的递送[19]。

目前，应用广泛的纳米基因载体可以分为3 种类型：无机纳米基因载体、天然高分子纳米基因载体、人工合成高分子纳米基因载体（表1）。无机纳米基因载体是一种粒径在1～100 nm 的无机纳米颗粒，具有尺寸小、种类多、易进行功能化修饰、稳定性好、可有效保护DNA 免受降解等优点[20]。天然高分子纳米基因载体是由天然的高分子如壳聚糖、淀粉等制成的，具有低毒性、生物相容性好、易生物降解等优点[21]。人工合成高分子纳米基因载体是由纳米材料和有机高分子材料复合而成的新型纳米材料，易于合成和制备，可规模化生产，易于进行表面修饰[21]。

2 纳米基因载体在植物遗传转化中的应用

2.1 无机纳米基因载体在植物遗传转化中的应用

常用的无机纳米基因载体主要有碳纳米管、碳点、介孔二氧化硅纳米颗粒、磁性纳米颗粒和量子点等。

碳纳米管是由单层或多层石墨烯片卷曲而成的中空无缝管状结构，可分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管[39]。LIU 等[24]首次发现单壁碳纳米管-DNA 复合物可穿透烟草悬浮细胞的细胞壁并通过内化作用进入细胞，表明单壁碳纳米管可用作向具有细胞壁的植物细胞进行基因运输的载体。天然碳纳米管因其表面高度疏水而不具备水溶性，通过共价或非共价修饰对其表面进行改性可提高其生物相容性和水溶性。利用PEG、聚乙烯亚胺、壳聚糖等修饰后的碳纳米管可静电吸附或包裹大量的生物大分子。KWAK等[22]利用壳聚糖修饰单壁碳纳米管后，在无外力或化学助剂作用下，将YFP（黄色荧光蛋白）基因递送到烟草、芝麻菜、菠菜等不同物种的叶绿体中，实现了YFP的瞬时表达。DEMIRER等[7]利用高纵横比的碳纳米管以高效率、无毒性、无机械辅助及无转基因整合的方式将质粒DNA 递送到烟草、小麦和棉花等植物中，实现了外源基因的有效递送和高水平的蛋白质表达，随后又利用单壁碳纳米管经静电作用结合siRNA，通过叶片注射的方式将siRNA 递送到完整的烟草叶片细胞内，在RNA 水平上实现了高效的基因沉默，并且单壁碳纳米管可以有效保护siRNA 不被细胞中核酸酶降解[23]。

碳点是一种由sp2、sp3杂化的碳核和各种表面官能团组成的粒径在10 nm 以下的新型发光纳米材料[40]。碳点尺寸小，毒性低，易于功能化修饰，制备简单，还具有良好的光稳定性和优异的生物相容性。因此，常作为载体用于基因、蛋白质和药物递送，并且在生物成像、荧光标记和生物传感等研究中发挥重要作用[41]。基于碳点易被功能化修饰这一特性，DOYLE 等[25]利用碳点携带基因编辑载体在小麦中实现了快速便捷的瞬时基因编辑，该研究使用PEG 修饰碳点后装载含有Cas9（CRISPR associated 9）和gRNA 的质粒，形成碳点-质粒复合物，通过直接喷洒叶片成功实现了对小麦SPO11（SPORULATION 11）基因的编辑。SCHWARTZ 等[26]利用携带沉默靶基因GFP的siRNA 的碳点，低压喷洒烟草和番茄的叶片，使烟草和番茄中的GFP基因的表达被沉默。

介孔二氧化硅纳米颗粒是硅氧化物纳米颗粒的一种，具有稳定的硅质结构和优异的机械强度，且表面富含硅羟基易被修饰[42]。介孔二氧化硅纳米颗粒既可以直接递送遗传物质，也可以辅助其他遗传物质递送方法（例如基因枪法），提高遗传物质的递送效率。TORNEY 等[6]利用孔径为3 nm 的蜂窝状介孔二氧化硅纳米颗粒装载GFP基因转化烟草，观察到了GFP的瞬时表达，随后又用金粉对介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道表面进行覆盖，并用基因枪轰击介孔二氧化硅纳米颗粒，成功将GFP基因递送至玉米愈伤组织中。MARTIN-ORTIGOSA 等[27]通过多次电镀的方法，用金粉修饰介孔二氧化硅纳米颗粒表面，装载质粒后，用基因枪分别轰击洋葱表皮细胞、玉米细胞和烟草细胞，相比TORNEY 等[6]的方法，进一步提高了转化效率。随后，MARTINORTIGOSA 等[28]再次利用金粉修饰的介孔二氧化硅纳 米 颗 粒 装 载 Cre（Cyclization recombination enzyme）蛋白递送到在筛选标记基因和报告基因两侧含有LoxP[Locus of X（cross）-over in P1]位点的转基因玉米中，在Cre/LoxP 重组酶系统的作用下，切除了转基因玉米中的筛选标记基因，并可通过肉眼直接筛选无筛选标记的转基因玉米，该研究为获得无筛选标记基因的转基因及基因编辑植株提供了新思路。CHANG 等[29]利用介孔二氧化硅纳米颗粒，在不借助任何机械外力的条件下，直接将红色荧光蛋白基因mCherry递送至拟南芥根系细胞中，转化效率高达46.5%。

磁性纳米颗粒是一种含铁、钴、镍等元素及其氧化物的纳米级大小的颗粒，具有优异的理化性质，包括尺寸小、表面积大、低毒性和活性表面易功能化等[43]，可辅助其他遗传转化方法，如超声波和电击法等，将装载外源物质的磁性纳米颗粒递送到植物细胞中。王凤华等[30]利用电击法将装载GFP基因的磁性纳米颗粒成功递送到水稻悬浮细胞中。同时，磁性纳米颗粒还具有超顺磁性和靶向性，在外加磁场的作用下，可将遗传物质定向递送到植物特定的组织或细胞中。ZHAO 等[13]利用磁性纳米颗粒Fe3O4作为载体，在外加磁场介导下将抗虫基因Bt（Bacillus thuringiensis）与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CPTI（Cowpea trypsin inhibitor）的双价基因BtΔα-CPTI输送至棉花花粉内部，将转化后的花粉通过人工授粉直接获得转基因种子，再经选育获得稳定遗传的抗棉铃虫转基因棉花后代，该方法将纳米磁转化和花粉介导法相结合，克服了传统转基因方法中组织再生困难和寄主依赖性等瓶颈，提高了遗传转化效率，缩短了周期。贾艳晶等[14]利用磁性纳米颗粒转化牡丹花粉，发现磁性纳米颗粒与其装载的DNA 的质量比合适时，可以保障纳米颗粒与DNA稳定结合，并且证明了花粉磁转化过程对花粉损伤较小，经磁转化之后的牡丹花粉萌发率在50%以上，与未处理的花粉萌发率相当。孙国胜等[15]通过将磁性纳米颗粒和带有Cas9的基因编辑载体质粒结合，在磁场作用下转化辣椒花粉，再经人工授粉收获辣椒种子，成功获得了辣椒T0种子，经鉴定转化效率（63.70%）远高于常规的基因枪转化法（4.2%），建立了辣椒可操作性强、转化效率高、低成本的遗传转化体系。纳米磁转化和花粉介导法相结合的遗传转化方法有很多优点，但该方法在植物中的普适性也存在疑问，如VEJLUPKOVA 等[44]通过花粉磁珠转化法未能成功转化单子叶植物玉米、高粱和百合。随后经过不断探索，WANG 等[10]对玉米花粉进行预处理，并将整个纳米磁转化过程在低温条件下进行，在保持花粉活力的前提下，大幅提高了玉米花粉萌发孔打开的效率，从而成功建立了磁纳米颗粒介导的不依赖基因型的玉米遗传转化体系。

量子点是一种由Ⅱ—Ⅵ族（如CdSe、ZnS、CdS等）、Ⅲ—V 族（GaAs 和InAs 等）或者Ⅳ—Ⅵ族元素组成的新型半导体纳米材料，此类纳米材料具有量子尺寸效应、良好的光稳定性和荧光特性，并且易于进行化学修饰[45]。在量子点纳米颗粒表面修饰上能识别抗体、蛋白酶等生物分子的功能化基团后，可以作为荧光探针用于标记、追踪活体细胞的活动及其动力学过程[45]，在量子点纳米颗粒上装载核酸后还可以用作植物转基因载体。RAVINDRAN 等[46]利用ZnS/CdSe 量子点作为荧光探针标记富含半胱氨酸的柱头/花柱黏着素，发现花柱黏着素在植物受精过程中发挥重要作用，该研究首次将量子点应用于植物发育过程的实时成像领域。董琛等[47]研究发现，在PEG 介导下，CdSe/ZnS 量子点可以经细胞的液相胞吞作用进入杂交鹅掌楸悬浮细胞内，且不会影响细胞活性，该研究为将CdSe/ZnS 量子点纳米材料用作植物转基因载体奠定了基础。FU 等[31]用多聚赖氨酸修饰的ZnS量子点装载带有GUS报告基因的质粒后，在超声波作用下，将GUS基因导入烟草叶片细胞中，并通过组织培养获得了稳定表达的转基因植株。SANTANA 等[32]设计了包覆有β-环糊精的亲水性量子点，由RbcS（Ribulose bisphosphate carboxylase small chain）引导肽识别叶绿体，定向地将化学物质（甲基紫精和抗坏血酸）成功递送到拟南芥叶绿体中，实现了外源物质向植物细胞器的靶向递送及对叶绿体氧化还原状态的调控，并且基于量子点的荧光特性，还研究了该纳米基因载体在植物体内的靶向传递途径。另外，研究发现，量子点对植物的生长会产生一些不良影响，比如高浓度碳量子点会导致小球藻细胞内氧化损伤，从而抑制其生长[48]，但可通过表面修饰减轻甚至消除其细胞毒性[49]。因此，随着对量子点纳米材料的深入研究及其表面修饰技术的发展，凭借其荧光特性，量子点有望发展成为一种可视化的植物转基因载体。

2.2 天然高分子纳米基因载体在植物遗传转化中的应用

在植物遗传转化领域应用较多的天然高分子纳米基因载体主要有壳聚糖纳米颗粒和淀粉纳米颗粒。

壳聚糖是一种由天然多糖甲壳素脱乙酰化后形成的多糖类物质，可在生物体内降解为二氧化碳和水，安全无毒。近年来，由壳聚糖制成的纳米材料被应用于植物遗传物质的递送。宋瑜等[11]利用壳聚糖纳米颗粒为载体，将GFP基因递送到了拟南芥叶片原生质体中。王凤华等[12]利用交联法制备了壳聚糖纳米颗粒，整合含有GFP基因的质粒后，利用基因枪法成功将GFP基因递送到洋葱表皮细胞中。但壳聚糖在生理条件下的稳定性低，导致壳聚糖纳米基因载体递送遗传物质的效率比较低，通过特殊的化学修饰可以提高其稳定性、特异性和在细胞内逃避降解的能力。朱蕴奇[50]制备了N，N，N-三甲基化壳聚糖，装载质粒后转化细胞，与未修饰的壳聚糖递送组相比，转化效率提高。壳聚糖还可以作为修饰剂修饰其他纳米基因载体。KWAK等[22]利用壳聚糖-单壁碳纳米管复合纳米材料以叶片注射的方式成功地将外源遗传物质递送到烟草、芝麻菜、菠菜等植物的叶绿体中，该研究为植物叶绿体遗传转化提供了新思路。

淀粉纳米颗粒是一种天然高分子纳米材料，无毒、可生物降解，且具有良好的生物相容性。由淀粉制成的淀粉纳米颗粒经修饰后带正电荷，可吸附带负电荷的核酸分子，从而作为基因载体用于遗传物质的递送。淀粉纳米颗粒的尺寸一般较大，穿透植物细胞壁的能力较弱，在应用过程中常需要额外的辅助与修饰。LIU 等[34]利用多聚赖氨酸修饰淀粉纳米颗粒后，在超声波介导下，将GFP基因成功递送到了盾叶薯蓣悬浮细胞中。WANG等[51]将多聚赖氨酸修饰的磁性淀粉纳米颗粒连接上异硫氰酸荧光素，制备出具有磁靶向性和荧光标记的新型纳米基因载体，既可用于研究纳米基因载体进入植物细胞的途径，又可实现外源物质向特定植物组织或细胞的靶向输送。孔倩倩[33]分别利用多聚赖氨酸和水溶性量子点修饰淀粉纳米基因载体，在超声波介导下成功转化了麻枫树愈伤组织和悬浮细胞。但超声波和基因枪等外力辅助会对外植体造成一定的损伤，后续可尝试使用PEG 和壳聚糖等对淀粉纳米颗粒进行修饰以提高转化效率[52]。

2.3 人工合成高分子纳米基因载体在植物遗传转化中的应用

人工合成高分子纳米材料主要包括树枝状聚合物纳米颗粒和DNA纳米结构等。

树枝状聚合物是一种结构清晰、高度分支化、单分散的纳米级合成高分子材料，其细胞毒性低、理化性质精准可控，且具有良好的分散性和生物相容性，表面带有大量可修饰的官能团，是制备纳米基因载体的良好模板[53]。常用的树枝状聚合物包括聚酰胺-胺型树枝状高分子聚合物、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺和聚乙二胺。其中，聚酰胺-胺型树枝状高分子聚合物和聚乙烯亚胺应用较多。

聚酰胺-胺型树枝状高分子聚合物纳米颗粒外部亲水、内部疏水，可以通过分子间作用力与核酸、多肽和蛋白质等生物大分子结合[54]。PASUPATHY等[35]利用聚酰胺-胺型树枝状高分子聚合物纳米颗粒经静电作用与带有GFP基因的质粒结合，成功将GFP基因递送到草坪草的愈伤组织中，并且通过优化缓冲液的pH 值以及聚酰胺-胺型树枝状高分子聚合物纳米颗粒与质粒DNA 混合的摩尔比等进一步提高了转化效率，最终转化效率可达48.5%。

聚乙烯亚胺纳米颗粒有较高的阳离子电荷密度，可通过静电作用吸附带负电荷的DNA，形成聚乙烯亚胺-DNA 复合物，是目前研究和利用最多的非病毒载体之一[55]。宋瑜等[11]和LI 等[36]先后利用聚乙烯亚胺纳米颗粒与质粒DNA 混合后转化拟南芥原生质体，成功将GFP基因递送到了拟南芥原生质体中，实现其瞬时表达，并且发现聚乙烯亚胺对质粒DNA 有良好的保护作用。但聚乙烯亚胺纳米颗粒很少单独作为载体使用，常用作其他纳米基因载体 的 修 饰 剂 。 DEMIRER 等[37]利 用 PEI（Polyethyleneimine）修饰单壁碳纳米管后，在无外部辅助的情况下成功地将带有GFP基因的质粒DNA转运到烟草、芝麻菜、小麦和棉花中，实现了GFP基因的瞬时表达。

DNA 是由2 条脱氧核糖核苷酸链经碱基互补配对形成的生物大分子，最初研究人员对DNA 的研究只围绕DNA 如何携带、复制和传递遗传物质，随着分子生物学的发展，SEEMAN 开创了DNA 纳米技术这一全新领域[56]。KALLENBACH 等[57]对核酸序列进行设计，使DNA 分子自组装形成基本的构建单元，再将这些构建单元进行自组装，即无需人工雕琢和复杂设备的组装，制备出了结构和功能可控的纳米组装体，即DNA 纳米结构。DNA 纳米结构具有天然的生物相容性、无细胞毒性、结构稳定性和良好的可编程性等优点。ZHANG 等[8，38]制备了一系列不同结构的DNA 分子后，装载靶向GFP基因的siRNA，转化烟草、芝麻菜和豆瓣菜等植物，发现DNA 纳米结构可以穿过植物细胞壁内化到植物细胞中，在没有外部辅助的情况下将siRNA 递送到成熟的植物组织中，实现基因沉默；另外，还发现DNA纳米结构的大小、形状、紧密性和硬度以及DNA 纳米结构和siRNA 的连接位点不仅会影响DNA 纳米结构向植物细胞的内化过程，还影响基因沉默的效率和途径。

3 展望

植物基因工程是定向改良植物遗传性状、实现作物精准育种的有力手段，打破了传统育种的瓶颈，实现产量与品质的同步提升[58]。不同于动物细胞，植物细胞具有细胞壁这一天然屏障，且植物细胞壁仅允许直径小于20 nm 的生物分子通过，阻碍了外源生物分子向植物细胞内传递[59]，这也是植物基因工程技术落后于动物基因工程技术的主要原因之一。

外源遗传物质向植物细胞的顺利递送是实现植物遗传转化的首要步骤，而植物遗传转化缺乏一种能允许递送不同生物分子进入所有植物物种和组织，且不需要借助外力、不引起组织损伤的转化方法。近年来，随着纳米生物技术的发展，植物遗传转化中的困难有望被解决。到目前为止，纳米基因载体介导的植物遗传转化已经取得一定进展，实现了烟草[6]、玉米[6，10]、拟南芥[11]、洋葱[12]、棉花[13]、牡丹[14]和辣椒[15]等植物的遗传转化。因为纳米材料介导的植物遗传转化研究时间较短，目前还存在一些问题，例如：纳米材料可能会对植物细胞产生毒性；纳米基因载体介导的遗传转化多以瞬时转化为主，稳定性较低，外源遗传物质经常不能整合到基因组中等。因此，需要研究制备对植物细胞安全无害的纳米材料，并优化转化方法。未来可尝试将纳米生物技术与其他学科相结合，制备可高通量使用、安全无害以及功能化的新型纳米材料，并进一步探究纳米材料在植物细胞内的转运机制及发挥作用后的降解机制。同时可尝试将纳米生物技术与其他基因工程技术相结合，例如与基因编辑技术相结合，可以利用大多数纳米基因载体的瞬时转化特性，对植物的茎尖或根尖分生组织进行瞬时转化，完成对目标基因的编辑，获得稳定遗传、不含任何外源遗传物质的后代；可以将纳米生物技术与其他常见转化方法如农杆菌介导法和基因枪法相结合，农杆菌和基因枪法介导的植物遗传转化必须经过愈伤组织再生过程，然而愈伤组织再生受基因型影响很大，可以利用纳米基因载体的瞬时表达特性，在愈伤组织再生阶段瞬时表达促进组织分化的基因，提高愈伤组织再生能力，从而提高农杆菌和基因枪法的转化效率，且转化后代不会携带组织分化基因。总之，利用纳米基因载体对植物细胞壁的穿透性强这一优点，经注射、喷施及侵染等方式可以将遗传物质递送至植物细胞中，完成对植物细胞的转化，未来随着对纳米材料理化特性和纳米基因载体转化机制的深入研究，可探索不依赖于植物组织培养的植物原位转基因技术；并可利用特殊纳米材料的磁靶向性，根据时空需要，实现对植物细胞、组织及器官的靶向转化。可以预见纳米基因载体在植物遗传转化领域将发挥更大的作用。