绵羊源十二指肠贾第虫和隐孢子虫的分子鉴定

睢攀博，徐菲菲，梁冠达，杜海利，郎家抒，李俊强

（1. 河南农业大学 动物医学院/农业农村部禽类产品质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450046；2. 河南省滑县动物卫生监督所，河南 滑县 456400）

十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）和隐孢子虫（Cryptosporidiumspp.）是可以感染人类和多种家畜的重要人兽共患寄生性肠道原虫[1]。这2 种原虫主要通过粪口途径传播，在世界范围内曾引起多起食源性和水源性的暴发和流行，对其防控具有重大的公共卫生意义[2-3]。当前我国大力支持发展养羊产业，同时也伴随着各种疾病的发生和传播，寄生虫感染往往导致慢性消耗性疾病，造成饲料转换率降低，经济效益下降[4]。

人兽共患贾第虫和隐孢子虫的感染一方面对家畜造成一定的危害，同时还伴随引起人类寄生虫病暴发的风险[2-3]。贾第虫和隐孢子虫是羊常见的肠道寄生虫，整个生产阶段均可感染。分子流行病学调查研究显示，羊是十二指肠贾第虫人兽共患集聚体A 和集聚体B 的重要保虫宿主，其感染的十二指肠贾第虫具有人兽共患传播的潜在威胁[5]。隐孢子虫作为引起幼龄动物腹泻的主要肠道病原之一，同样能够导致羔羊显著临床症状甚至死亡，给养羊业带来较大经济损失，同时也具有重要的人兽共患传播风险[5-6]。

目前，我国多地已经报道了绵羊源十二指肠贾第虫和隐孢子虫的分子鉴定，然而对于安阳市的报道较少。为此，采用特异性巢式PCR 检测方法，对获得的安阳市绵羊源贾第虫和隐孢子虫分离株进行PCR 鉴定、分子特征分析以及种系发育进化分析，以期了解安阳市属5 县（市）绵羊源十二指肠贾第虫和隐孢子虫的分子生物学特征，及潜在人兽共患传播风险奠定基础，为该地人兽共患风险评价提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 样品来源

基于卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖溶液漂浮法分别对安阳市属5县（市）（滑县、内黄县、汤阴县、林州市、安阳县）采集的880 份绵羊新鲜粪便样品，进行显微镜形态学的镜检，观察寄生虫感染情况，共获得16 份绵羊源十二指肠贾第虫和3 份隐孢子虫阳性粪便样品，保存于2.5%的重铬酸钾溶液。

1.2 粪便中病原DNA的提取

使用商业化粪便DNA 提取试剂盒Stool DNA Kit（D4015-02，OMEGA Bio-Tek 公司）提取粪便样品中病原DNA。在DNA 提取之前，将粪便样品中的重铬酸钾冲洗完全，然后取200 mg 样品，严格按照试剂盒推荐的DNA 提取步骤进行操作。提取获得的病原基因组DNA，溶解并保存于200 μL Elution Buffer（10 mol/L Tris Buffer，pH 值8.5）溶液中，备用。

1.3 巢式PCR扩增

十二指肠贾第虫的巢式PCR 扩增基于16S rRNA 基因位点，参照APPELBEE 等[7]设计的引物和扩增条件，扩增酶为TaKaRa LATaq®扩增酶（购自郑州久是生物技术有限责任公司），使用GC BufferⅡ（含Mg2+），扩增目的片段约长298 bp。隐孢子虫的巢式PCR 扩增基于18S rRNA 基因位点，参照XIAO 等[8]设计的引物和扩增反应条件，扩增酶使用高保真KOD-plus（KOD-201），扩增目的片段约长850 bp。PCR 反 应 体 系 均 为25 μL，包 括Buffer 2.5 μL（十二指肠贾第虫为GC Buffer，隐孢子虫为KOD-plus Buffer）、dNTP（10 mmol/L）2.5 μL、上下游引物（20 μmol/L）各1.5 μL、模板DNA（约50 ng/μL）2 μL、DNA 聚合酶1 μL 和ddH2O 14 μL。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成部合成。每次PCR 扩增反应均分别设置阳性对照（分别为绵羊源十二指肠贾第虫DNA 和泛在隐孢子虫DNA）和阴性对照（不含任何DNA的去离子水）。

1.4 扩增产物电泳和测序鉴定

分别取5 μL 第2 次PCR 扩增产物与2 μL 溴酚蓝上样缓冲液（Loading Buffer）充分混匀，并将其置入1.5%琼脂糖凝胶中电泳，然后转移到凝胶成像系统仪中成像。对于电泳阳性样本分别使用DNA 测序仪（ABI PRISMTM3730 XL DNA Analyzer），基于测序反应试剂盒（ABI PRISMR BigDyeTMTerminator V3.1 Cycle Sequencing Kit）进行测序鉴定，测序过程委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。为保证序列的准确性，阳性DNA 样本扩增子均采用正、反双向测序鉴定。所获得下机数据使用Chromas 软件进行可视化，并使用DNAstar-EditSeq软件包进行序列的拼接与校准。

1.5 种系发育进化分析

将本研究获得的十二指肠贾第虫16S rRNA 基因序列和隐孢子虫18S rRNA 基因序列分别与GenBank 数据库中的已知序列进行BLAST（Basic local alignment search tool）比对，确定其种类或基因亚型。所获得的序列和参考序列使用ClustalX 2.1软件进行序列比对分析，采用MEGA 7.0 基于邻接法（Neighbor-Joining）构建分子系统发育进化树，系统发育进化树分枝可信度的检验使用bootstrap进行分析，用1 000个重复进行检验。

2 结果与分析

2.1 十二指肠贾第虫和隐孢子虫PCR扩增鉴定

十二指肠贾第虫和隐孢子虫阳性粪便样品，经过巢式PCR 分别在目的片段附近成功扩增16 份和3 份，扩增成功率均达到100%。部分琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

图1 绵羊源十二指肠贾第虫16S rRNA基因位点和隐孢子虫18S rRNA基因位点的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of 16S rRNA gene for G.duodenalis（A）and 18S rRNA gene for Cryptosporidium spp.（B）in sheep

2.2 十二指肠贾第虫和隐孢子虫序列分析

基于十二指肠贾第虫16S rRNA 基因位点对16份PCR 产物进行测序鉴定，所得序列在GenBank 数据库中用BLAST 进行同源序列比对，使用MEGA 7.0 软件进行16S rRNA 序列间的比对分析，结果显示，分离的十二指肠贾第虫为集聚体A（n=1）和集聚体E（n=15）。本研究中获得的集聚体A 分离株与荷兰狍子（Roe deer）十二指肠贾第虫分离株集聚体A（登录号：DQ100287）序列同源性为100%，且无碱基差异；获得的15 条集聚体E 序列之间无碱基差异，且均与荷兰山羊十二指肠贾第虫分离株集聚体E（登录号：AY826208）序列100%一致。

基于隐孢子虫18S rRNA 基因位点对3 份PCR产物进行测序，所得序列同样在GenBank 中用BLAST 进行同源序列比对。使用MEGA 7.0 软件进行18S rRNA 序列间的比对分析，结果显示，分离的隐孢子虫鉴定为泛在隐孢子虫C.ubiquitum（n=2）和猪隐孢子虫C.suis（n=1）。本研究中获得的2条泛在隐孢子虫序列之间无差异，均与河南绵羊分离株C.ubiquitum（登录号：MH794165）序列100%一致。本研究中获得的猪隐孢子虫与河南之前分离的猪隐孢子虫分离株（登录号：MH178034）序列100%一致。

2.3 十二指肠贾第虫和隐孢子虫分离株的地理分布

基于PCR 扩增的分子鉴定显示，安阳市绵羊源十二指肠贾第虫的总体平均感染率为1.82%（16/880），隐孢子虫的总体平均感染率为0.34%（3/880）。从地理分布上来说，在滑县（3）、内黄县（5）、林州市（6）和安阳县（2）等4个采样地区的绵羊粪便样品中共检测到16份十二指肠贾第虫；在滑县（1）、内黄县（1）和林州市（1）等3个采样地区的绵羊粪便样品中共检测到3份隐孢子虫。本研究中无十二指肠贾第虫和隐孢子虫混合感染情况（表1）。

表1 河南省安阳市属5县（市）绵羊十二指肠贾第虫和隐孢子虫的感染情况Tab.1 The infection of Giardia duodenalis and Cryptosporidium spp.from sheep in five counties of Anyang，Henan Province

2.4 十二指肠贾第虫和隐孢子虫分离株种系发育进化分析

16 份羊贾第虫的16S rRNA 基因PCR 扩增产物长度约为298 bp。种系发育分析表明，本研究分离的16 份绵羊源贾第虫分离株均与之前报道的G.duodenalis在同一进化分枝上，并与作为外群的组织滴虫16S rRNA 基因序列（Histomonas meleagridis：AJ920323）在不同进化分枝上（图2）。

图2 基于十二指肠贾第虫16S rRNA基因序列构建的邻接进化树Fig.2 Neighbor-joining tree based on 16S rRNA gene sequences of Giardia duodenalis

3 份羊隐孢子虫的18S rRNA 基因的PCR 扩增产物长度约为850 bp。种系发育进化分析表明，本研究所分离的3份羊隐孢子虫分离株均与隐孢子虫在同一进化分枝上。其中2份分离株与泛在隐孢子虫（C.ubiquitum）进化关系较近，剩余1 份分离株与猪隐孢子虫（C.suis）进化关系较近。本研究的分离株与作为外群的组织滴虫18S rRNA 基因序列（Histomonas meleagridis：AJ920323）在不同进化分枝上（图3）。

图3 基于隐孢子虫18S rRNA基因序列构建的邻接进化树Fig.3 Neighbor-joining tree based on 18S rRNA gene sequences of Cryptosporidium spp.

3 结论与讨论

十二指肠贾第虫和隐孢子虫均是绵羊感染的常见肠道寄生性原虫，主要引起宿主腹泻、腹胀、营养不良和体质量减轻等临床症状。前人研究结果显示，羊源十二指肠贾第虫感染以集聚体E为主，常伴有集聚体A 和E 或集聚体A、B 和E 的混合感染[5-6]。本研究中，基于16S rRNA基因位点对绵羊源贾第虫阳性样品进行巢式PCR 扩增和序列分析，共发现2 种十二指肠贾第虫集聚体，分别为集聚体A和E，并且集聚体E 是优势虫种（93.75%，15/16）。希腊、挪威、伊朗、阿尔及利亚和澳大利亚等国家报道的绵羊源十二指肠贾第虫均以集聚体E 感染为主[9-13]。国内的内蒙古、黑龙江、安徽和河南等省区羊感染的基因型主要为集聚体A 和集聚体E，以集聚体E 为主，与本研究结果一致[14-17]。十二指肠贾第虫集聚体A 具有较宽的宿主范围，可感染包括人在内的多种哺乳动物，如犬、猫、家畜和野生动物，拥有较大的人兽共患潜力[18]。集聚体E 通常发现于奶牛、绵羊和山羊等反刍动物。然而也有报道从人类中获得集聚体E分离株，但其感染率较低[19]。

目前，在绵羊中已鉴定9种隐孢子虫，但常见的隐孢子虫病原株有3 种，即微小隐孢子虫（C.parvum）、泛在隐孢子虫（C.ubiquitum）和肖氏隐孢子虫（C.xiaoi），这3 种隐孢子虫在流行程度、地理分布和公共卫生重要性等方面都有所不同[5]。本研究中，基于18S rRNA基因位点对隐孢子虫阳性样品进行巢式PCR 扩增和序列分析，共发现2 种隐孢子虫种类，分别为泛在隐孢子虫和猪隐孢子虫，且泛在隐孢子虫是优势虫种。在之前的报道中，泛在隐孢子虫在野生和驯养的反刍动物、啮齿动物、食肉动物和包括人类在内的灵长类动物中都有报道，具有重要的人兽共患潜力[6]。猪隐孢子虫是感染猪的主要隐孢子虫种[20]。然而，涂蕊[21]在四川地区的山羊粪便样品中也检测到猪隐孢子虫，且序列与英国人源猪隐孢子虫的序列具有100%的同源性。因此，本研究中检出的绵羊源猪隐孢子虫亦具有人兽共患传播风险。

本研究进一步丰富了河南省安阳市属5县（市）绵羊源十二指肠贾第虫和隐孢子虫的流行病学基础数据，将有助于了解这2种病原的感染流行情况，从而为今后制定适当的控制和预防计划奠定基础。鉴定的病原均具有一定的人兽共患潜力，提示绵羊肠道寄生虫的防控也具有重要的公共卫生意义。