miR-130b-3p靶定AMPK基因抑制糖饥饿诱导的宫颈癌细胞自噬性死亡

范彩红 杨磊 杨澜 穆红

1天津医科大学一中心临床学院（天津300192）；2天津市第一中心医院检验科（天津300192）

宫颈癌是导致全球女性癌症死亡的第二大原因，每年有50 多万新发病例，严重损害着女性的健康，传统的手术、放化疗方法效果不尽如人意，因此亟待研究发展出新的治疗方法应用于临床［1］。近些年，随着对肿瘤细胞代谢的深入探究，发现肿瘤细胞的葡萄糖代谢途径与正常细胞有显著差异，基于此提出了“饥饿疗法”的概念［2］。营养剥夺成为治疗肿瘤的一种手段，但研究发现，在葡萄糖缺乏等应激条件下，癌细胞可以利用灵活的代谢程序维持生存能力［3］，这使得营养剥夺治疗肿瘤的疗效不理想，因此探索其耐受机制，强化肿瘤治疗效果极为重要。

自噬是细胞通过溶酶体降解细胞内容物，回收并利用的机制［4-5］。一方面，自噬通常被看作是饥饿等应激条件下细胞的一种重要存活机制，在一定适当的水平促进细胞生存［6］；然而另一方面，自噬是细胞死亡的一个阈值，强制过度激活超过自噬阈值会导致细胞死亡［7］，例如凋亡相关因子Par-4 诱导人恶性胶质瘤细胞自噬性细胞死亡［8］。自噬性细胞死亡（autophagic cell death，ACD）是一种由自噬介导的细胞死亡形式，具有独特的形态学特征，主要表现为自噬体和自溶体在细胞质中的积累。细胞死亡没有表现出凋亡或坏死样细胞死亡的特征，可以通过测量质膜通透性来评估，并且可通过自噬抑制剂或自噬相关蛋白基因敲除加以抑制［9］。因此，在营养缺乏刺激下，促进过度自噬并激活ACD 似乎是一种新的癌症治疗策略。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约为22～25 个核苷酸的小RNA，它们与肿瘤发生发展密切相关［10］，并且也是调控细胞内自噬相关信号通路的重要因子［11］。目前，生酮饮食联合化疗治疗肿瘤，能显著增加化疗药物药效并减少副作用［12］，但仍存在选择性差、易产生耐药性的问题，然而基于miRNA的治疗靶向性强、精准度高，能够更加有效治疗肿瘤［13］。但目前关于miR-130b-3p与饥饿疗法的联合应用以及机制研究鲜有报道。本研究发现糖饥饿可以诱导宫颈癌细胞发生自噬，miR-130b-3p 在防止细胞发生过度自噬过程发挥重要作用。本研究新发现为全面阐明miRNA 调控腺苷单磷酸激活激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）相关自噬的分子机制提供了有用的线索，也为探索miRNA辅助饥饿疗法下宫颈癌的治疗提供了一些新的见解。

1 材料与方法

1.1 材料宫颈癌Siha、Hela 细胞（美国ATCC 公司）；细胞培养箱（美国Thermo Fisher 公司）；荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司）；流式细胞仪（美国BDSciences 公司）；凝胶成像分析仪（美国Alpha Innotech 公司）；LipofectamineTM3000（美国Thermo Fisher 公司）；GFP-LC3B 质粒（湖南科爱医疗器械有限公司）；雷帕霉素、SBI-0206965（美国默克公司）；p-ULK1 抗体（美国Abcam 有限公司）；兔抗人腺苷单磷酸激活激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、LC3 抗体（美国CST 公司）；β-actin、HRP 标记羊抗兔抗体（美国Proteintech 公司）；PI 检测试剂盒（天津三箭生物技术股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转染宫颈癌细胞在含有8%～10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的MEM 细胞培养基中培养，于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中孵育。取指数期细胞计数后按照所需密度种于孔板中，待细胞贴壁后，利用LipofectaminTM3000 将miR-130b-3p模拟物、NC、miR-130b-3p抑制物、抑制物NC、pcDNA3.1：：AMPK、pcDNA3.1、pcDNA3.1：：AMPK-wtUTR 和pcDNA3.1：：AMPK-mutUTR、GFPLC3B 质粒分别转染细胞。

1.2.2 实验分组根据处理条件，以及转染物质的不同分为以下几组：正常糖含量组与低糖组、低糖+DMSO 组与低糖+雷帕霉素组、NC 组与模拟物组、抑制物NC 组与抑制物组、pEGFP：：wtUTR组和pEGFP：：mutUTR 组、抑制物NC+SBI 组与抑制物+SBI 组、pcDNA3.1 组与pcDNA3.1：：AMPK 组、pcDNA3.1+SBI 组与pcDNA3.1：：AMPK+SBI 组。

1.2.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）用TB Green 进行RT-qPCR 检测miR-130b-3p、内参U6、AMPK mRNA、内参β-actin mRNA 表达水平，按公式：Folds=2-ΔΔCt，△△Ct=（Ct1-Ct2）-（Ct3-Ct4），计算出每组细胞中基因的相对表达水平。miR-130b-3p引物序列U：5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'，D：5'-TGCAATGATGAAAGGGCAT-3'；U6 引物序列F：5'-CGCTTCGGCAGCACAT-3'，R：5'-ATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'；ampk 引物序列F：5'-GCGACAAGCCCACCTGAT-3'，R：5'-ATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'；β-actin 引物序列F：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，R：5'-TGTCACCTTCACCGTTCCAGT-3'。

1.2.4 过表达质粒载体的构建按照商品使用说明（TaKaRa，日本），使用AMPK-RT，通过逆转录反应合成AMPK mRNA 编码区的cDNA，再依次使用两对引物akF1、akR1 和akF2、akR2 通过PCR 扩增含有Kozak 序列和AMPK 基因编码序列的DNA 片段，纯化后酶切DNA 片段，连接到pcDNA3.1 载体的KpnI-XhoI 克隆位点，使用T4 DNA 连接酶构建pcDNA3.1：：AMPK载体。AMPK-RT：5'-AACAAAGAGGGAGGGAT-3'；AMPK F1：5'-CCGCCACGATGCGCAGACTCAGTTC-3'；R1：5'-TTGCATGGCGCTTTCTGTTTATTGTGCAAG-3'；AMPK F2：5'-CGGAATTCGCCGCCACGATGCG-3'；AMPK R2：5'-CCGCTCGAGGCATGGCGCTTTCTGT-3'

1.2.5 Western blotPBS 清洗6 孔板中细胞后，加入150 μL RIPA 裂解液，静置30 min 后，用刮板刮取细胞蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量，取总蛋白30 μg 上样，配制10 %的SDS-PAGE 凝胶分离，电泳后转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，随后分别加入一抗，4 ℃过夜后，TBST 清洗4 次，之后加入二抗室温孵育1 h，TBST 清洗4 次，最后化学显色液显色，Image J 分析灰度值。

1.2.6 细胞死亡率检测消化收集各组细胞，加入600 μL 固定液清洗细胞，100 μL 固定液重悬细胞，加入PI 染液5 μL，避光孵育5 min，立即上流式细胞仪检测，实验重复3 次。

1.2.7 GFP-LC3B实验细胞（1×105/孔）接种在爬片上并在12 孔板中过夜培养，使用LipofectamineTM3000 转染GFP-LC3B 质粒6 h 后，更换新鲜培养基48 h 后刺激，用4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS冲洗3 次。使用荧光显微镜拍摄图像。为了定量，在每个实验条件下至少计数100 个细胞中GFPLC3B 斑点，并使用Image J 中的共定位工具对绿色和红色荧光共定位进行定量。

1.2.8 荧光报告基因实验TargetScan、miRDB、PicTar、DIANA 在线数据库预测到miR-130b-3p 与AMPK mRNA3'-UTR 存在靶向结合位点，根据生物信息学预测结果，将AMPK mRNA3'-UTR 模拟物及突变体，分别构建嵌入到荧光报告载体pEGFP 下游BamHI-XhoI克隆位点上，该模拟物合成由上海吉玛制药技术有限公司完成。将构建好的重组载体质粒分别与miR-130b-3p 模拟物及NC 共转染宫颈癌细胞，48 h后分别测定荧光强度，实验重复3次。

1.3 统计学方法实验数据利用GraphPadPrism 8.0 软件分析并绘图。在对照组中获得的数据的平均值被定义为1 或100%，以使不同试验组中表达的靶基因的水平标准化。用SPSS 16.0 软件对实验数据的正态分布进行了验证。不成对t检验用于对数据进行统计评估，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低糖诱导宫颈癌细胞自噬和耐受与正常糖含量组相比，低糖组细胞死亡率差异无统计学意义（均P＞0.05，图1A）；低糖显著诱导GFP-LC3B斑点的形成（均P＜0.001，图1B）；与正常糖含量组相比，低糖组LC3 蛋白水平均显著性增加、p-ULK1（Ser757）蛋白水平显著降低（均P＜0.001，图1C）。

图1 低糖条件下对宫颈癌细胞死亡、自噬水平的影响Fig.1 Effects of low glucose on death and autophagy of cervical cancer cells

2.2 过度自噬诱导宫颈癌细胞死亡与低糖+DMSO组相比，低糖+雷帕霉素组宫颈癌细胞死亡水平率显著升高（均P＜0.001，图2）。

图2 过度自噬诱导宫颈癌细胞死亡Fig.2 Excessive autophagy induces death of cervical cancer cells

2.3 低糖条件下miR-130b-3p 和AMPK 变化情况低糖条件下，AMPK 蛋白水平呈现显著性降低趋势（均P＜0.01，图3A）；RT-qPCR 实验结果显示，与正常糖含量组相比，低糖组AMPK mRNA 显著性下降；miR-130b-3p 表达水平显著性升高（均P＜0.05，图3B-C）。

图3 低糖条件下miR-130b-3p、AMPK mRNA 和蛋白水平变化Fig.3 Changes of miR-130b-3p，AMPK mRNA and protein levels under low glucose conditions

2.4 miR-130b-3p 直接靶定AMPK 基因Target-Scan、miRDB、Pic Tar、DIANA 在线数据库预测结果（图4A）显示，miR-130b-3p 与AMPK mRNA 3'-UTR存在靶向结合位点，提示AMPK可能是miR-130b-3p的靶基因。与NC 组相比，模拟物组AMPK mRNA水平以及蛋白水平显著降低（均P＜0.05，图4B）；而转染抑制物后则趋势相反（均P＜0.05）。荧光报告基因实验结果证实，转染miR-130b-3p 模拟物可显著抑制pEGFP：：wtUTR组的荧光强度（P＜0.05），而对于pEGFP：：mutUTR 的荧光强度无显著影响（P＞0.05，图4C）。

2.5 miR-130b-3p抑制物诱导ACD与抑制物NC组相比（图5A），抑制物组死亡率显著高于对照组（均P＜0.001）；抑制物NC+SBI 组与抑制物+SBI 组细胞死亡率差异无统计学意义（均P＞0.05）。转染miR-130b-3p抑制物显著增加GFP-LC3B斑点细胞的形成（P＜0.01，图5B）；与抑制物NC组相比，抑制物组LC3蛋白水平显著升高（均P＜0.05，图5C）；p-ULK1（Ser757）蛋白水平呈现显著降低趋势（均P＜0.05）。

图5 miR-130b-3p 抑制物对细胞自噬和死亡的影响Fig.5 Effects of miR-130b-3p inhibitor on autophagy andcell death

2.6 AMPK 诱导ACD与pcDNA3.1 组相比（图6A），pcDNA3.1：：AMPK 组的死亡率显著增加（均P＜0.01）；pcDNA3.1+SBI 组与pcDNA3.1：：AMPK+SBI 组细胞死亡率差异无统计学意义（均P＞0.05）。过表达AMPK 显著诱导细胞内GFP-LC3B斑点的形成（P＜0.01，图6B）；与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1：：AMPK 组LC3 蛋白显著升高（均P＜0.01，图6C）；p-ULK1（Ser757）显著性降低（P＜0.01）。

图6 过表达AMPK 对细胞自噬和死亡的影响Fig.6 Effects of overexpression of AMPK on cell autophagy and death

3 讨论

研究表明不同类型肿瘤细胞的低糖耐受能力是不同的，低糖条件虽然可以加速脑胶质瘤细胞的死亡［14］，但并不会诱导肝癌细胞发生死亡［15］，为了检测宫颈癌细胞是否存在低糖耐受现象，本研究采用低糖刺激，结果发现宫颈癌Siha 和Hela 细胞死亡率无差异，这证明其也存在低糖耐受现象。有研究报道［16］称在葡萄糖缺乏的应激过程中，细胞通过抑制mTOR 表达从而激活自噬。低糖条件下，在宫颈癌细胞中，本研究也发现自噬相关蛋白LC3、GFP-LC3B 斑点显著增加，这些结果表明，葡萄糖饥饿同样会引起宫颈癌细胞的自噬。然而，众所周知自噬是把“双刃剑”，适当程度的自噬，有助于细胞生存，但过度的自噬就会导致细胞的死亡，即ACD 的发生。在多骨髓瘤细胞中，高水平的自噬可导致半胱氨酸蛋白酶非依赖性自噬细胞死亡［17］。为进一步验证过度自噬是否同样诱导宫颈癌细胞ACD，本研究采用饥饿与雷帕霉素联合刺激，结果发现宫颈癌细胞LC3 蛋白、GFP-LC3B 斑点显著增加，细胞死亡率也显著增加，这也说明了过度自噬同样可以诱导宫颈癌细胞ACD 的发生。

葡萄糖缺乏等应激条件下，会激活多种上游信号通路参与自噬调节，包括AMPK/mTOR。AMPK是真核细胞中最重要的分子能量传感器之一，其在维持能量稳态中起关键作用［18］，一方面，AMPK磷酸化激活位点Thr172 活化后，通过抑制ULK1 抑制性磷酸化位点Ser757 的活化促进自噬诱导；另一方面，AMPK 负性调节mTOR 诱导自噬，然而AMPK 的持续激活导致糖酵解和葡萄糖氧化的解偶联，增加胞浆蛋白水平和酸中毒，并引起过度自噬至有害水平，诱导ACD 的发生［19］。本研究中，低糖条件下，AMPK mRNA 以及蛋白表达量水平降低表明AMPK 可能参与到糖饥饿下自噬性细胞死亡的调节，为更直观地证明关于AMPK 作用猜想，笔者过表达AMPK 发现其促进低糖下细胞自噬，诱导细胞死亡，并且这种死亡可以被自噬抑制剂SBI-0206965 所逆转，因此AMPK 的过表达可以诱导宫颈癌细胞过度自噬进而导致ACD，低表达水平的AMPK 抑制了宫颈癌细胞ACD。

miRNAs 通过靶向不同信号通路中的基因，与ACD 调节过程密切相关。研究发现，转染miR-20b抑制剂后，抑制METTL3 的表达，从而诱导了内皮细胞的ACD［20］，miR-22-3p 的过度表达抑制凋亡蛋白IAP 的表达，诱导自噬细胞引起的死亡［21］。本研究中，低糖条件下，miR-130b-3p 水平升高，这表明miR-130b-3p 可能也参与到糖饥饿下自噬性细胞死亡的调节。因此转染miR-130b-3p 抑制物后，降低miR-130b-3p 水平，结果发现宫颈癌细胞自噬显著升高，细胞死亡率显著增加，并且这种死亡可以被自噬抑制剂SBI-0206965 所逆转，因此抑制miR-130b-3p 的表达可以诱导宫颈癌细胞过度自噬促进细胞ACD 的发生。此外，miRNAs 通过与靶基因3'UTR 区域互补结合来调节其表达水平。有趣的是，在本研究中利用生物信息学软件预测到AMPK 3'UTR 中miR-130b-3p 的假定靶定位点。为进一步验证二者靶定关系，分别转染了miR-130b-3p 模拟物和抑制物，miR-130b-3p 模拟物降低AMPK mRNA 和蛋白水平，miR-130b-3p 抑制物则趋势相反，这些结果说明二者有靶定关系。miR-130b-3p 模拟物导致编码野生型3'UTR 的DNA 序列的报告基因表达水平下降，但没有3'UTR 序列或编码突变型3'UTR 的序列的报告基因水平没有明显下降，这进一步说明了miR-130b-3p 与AMPK具有直接靶定关系。

总之，本研究发现miR-130b-3p 下调AMPK 的表达，抑制过度自噬诱导的ACD，实现宫颈癌细胞低糖下的生存。本研究强调了miRNA 在宫颈癌治疗中的重要作用，为辅助饥饿疗法治疗宫颈癌提供新的参考。目前，饥饿疗法还未广泛应用临床治疗，miRNA 作为治疗靶点治疗肿瘤仍仅限于少数癌症种类，故miRNA 辅助饥饿疗法仍有很长的路要走。