液相色谱-串联质谱联用仪器管理与维护

王倩(南京中医药大学科技实验中心, 江苏 南京 210046)

0 引言

液相色谱(LC)是根据目标化合物在色谱柱中保留时间的差异，并将化合物从混合物中分离出来，进行收集及检测的仪器[1-2]。质谱(MS)是把分子转化成气态离子，并根据质荷比(M/Z : M质量数，Z电荷数)的差异把离子进行分离检测的仪器[3]。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)在过去的10～15年里在临床实验室取得了巨大的增长。对低分子量分析物，它具有优于免疫分析法或传统的高效/压力液相色谱(HPLC)的分析特异性，并且比气相色谱-质谱(GC-MS)具有更高的通量[4]。为更好地延长仪器寿命、降低耗材成本并维持仪器的良好状态，获得更可靠的分析数据，仪器的日常维护及保养至关重要。以下以岛津公司CTO-30A高效液相色谱与AB SCIEX公司QTRAP 4500质谱联用为例，从仪器结构特点出发，结合日常工作，总结使用过程中的常见问题及经验进行阐述。

1 培训与管理

1.1 仪器预约与管理

平台目前采用线上预约的方式进行仪器的培训以及预约使用申请。HPLC-QTRAP 4500 液质联用仪是实验室大型分析仪器，应有专业技术人员专门管理。通常采用送样测试的方式进行日常的分析测试工作。通常情况下，在预约测试样品前，送样人员应与仪器管理者进行有效沟通，常见于探讨仪器本身是否可以满足实验目的。确定可行性后就分析测定的化合物性质、样品的前处理方法、色谱柱的选择、流动相的配制以及耗材的准备等方面再进行进一步的方法制定。在预约规定的时间，送检人员将所需测定的样品提供给仪器管理者进行上机测定，样品测定完成后，仪器管理员进行数据处理和分析，并将检测结果用格式化的光盘进行存储并将实验数据转交给送样人员。液质联用仪是大型分析精密仪器，在日常的使用中若因样品处理不当或者操作不当，轻则造成仪器污染导致仪器寿命缩短，重则损坏仪器从而花费高额的维修费用。因此，需要仪器管理人员专门进行操作。然而，因液质联用仪应用广泛，日常需测定的样本量巨大，服务的人员众多，仪器管理人员难以做到事无巨细。因此，平台每年都会举办液相色谱质谱联用仪器理论及操作培训，主要以开展讲座以及仪器上机培训为主。包括但不限于介绍仪器的基本原理、仪器在使用过程中遇到的问题及解决方案、数据的处理以及结果的分析等方面。对培训合格以及多次考核均满足要求者，方可允许其独立进行仪器的操作。独立使用仪器者必须严格遵守质谱仪器实验室制定的相关规章制度，严格按照培训的操作规程使用仪器。样本如需要过夜进样时需与仪器管理人员报备。操作者若违反质谱实验室规定而造成仪器故障并影响性能者，将被取消仪器使用资格。在使用过程中仪器出现任何问题或者故障，仪器使用者应及时通知仪器管理员，采取相应措施进行补救以免对仪器造成更严重的损害。

1.2 样品前处理

明确样品类型是送样人员首先要提供给仪器管理者的信息，针对不同的样品类型，如生物样本、药用植物、食品及化妆品等前处理方法是有区别的。除此之外，样品溶液要排除含有生物大分子、无机酸、难挥发的盐、表面活性剂等。此外，样品只限于甲醇、乙腈、水中的一种或者其组合进行样品溶解，离心后并采用0.22 μm的滤膜过滤(注意：水系膜与有机系膜选用区别)，特殊情况下如样品量较少无法完成滤膜过滤，应采用高速离心机4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min后取上清液进行进样分析。确保样品溶液透明且无沉淀等现象。鉴于质谱的灵敏度高，防止因溶剂的杂质较多影响实验结果的准确性。选用溶剂溶解样品时要注意其纯度，如甲醇/乙腈选用包装明确标注为质谱级或色谱级溶剂，水要选用一级水。为了防止因样品浓度过高造成色谱柱残留或者离子源污染等情况的发生，样品的浓度应控制在小于1 μg/mL最佳。

2 日常使用与保养

2.1 环境要求

液质联用仪器的正常运行对环境要求较为苛刻，仪器周围的电磁感应装置会影响液质联用仪器正常运行。因此需要维持环境温度在20～24 ℃，湿度保持在35%～50%。一般日常室温与最后一次校正时相差4 ℃以内。并且需要保证温度的变化率小于2 ℃/h。若环境温度变化率过大，会造成质谱仪质量轴偏移，分析测定结果不准确。另外，质谱仪房间一定要妥善保持通风，实验室良好的通风环境用以控制有机试剂等有毒有害物质排放，保证仪器正常运行。除此之外，实验室日常要进行除尘工作，防止房间灰尘过多造成质谱仪电路板短路等情况的发生。

2.2 液相色谱系统

2.2.1 流动相

液相色谱系统作为质谱的进样系统有着不可忽视的作用。液相色谱质谱联用时，流动相的选择至关重要。尽量选用质谱(MS)级别的甲醇/乙腈作为有机相，若流动相为色谱(HPLC)级，应采用0.22 μm有机系滤膜过滤后使用。严禁采用分析级及更低纯度的甲醇/乙腈作为流动相，流动相中严禁含有难挥发的盐类，如磷酸盐、硼酸盐等；流动相中严禁使用含有抑制化合物电离的表面活性剂；严禁使用盐酸、硫酸等无机酸。配备完成的流动相应先进行脱气，一般超声5 min左右就可以完成脱气的目的。一般水相做到现配现用，有机相可保存1个月左右。若流动相含有盐类，在每次实验结束后应先采用高比例的纯水进行冲洗，然后逐渐升高有机相比例，此操作的目的是将残存的盐类排出，避免腐蚀管路系统。

2.2.2 色谱柱

液质联用仪与单独的液相色谱仪相比，显著的区别在于配备的色谱柱较短以及流速的相对较低。以便样品在进入离子源时能够完成很好的电离。因此，在实验开始前应根据所测化合物的性质选择合适的色谱柱，包括色谱柱长度、粒径大小、填料种类、pH值范围、所耐受的压力以及其与后方质谱的兼容性等问题。

对新购买的色谱柱，首次使用前应进行活化，以常用的普通反相C18色谱柱为例，一般采用0.5 mL/min的甲醇进行冲洗大约120 min，然后更换流动相进行平衡操作。建议实验开始前及实验结束后都应进行色谱柱的冲洗，一般先用高比例纯水，约90%的纯水/甲醇体系进行色谱柱的冲洗，然后逐渐提高有机相比例，最后色谱柱保存在纯甲醇中。注意冲洗色谱柱时应断开与质谱的管路连接，防止将污染物冲进离子源导致离子源污染。在色谱柱冲洗完成后，用二通替换色谱柱，然后用50%甲醇/水以1 mL/min流速冲洗质谱仪约30 min左右。若长时间不使用此色谱柱，为防止甲醇挥发，造成色谱柱的柱效下降，应将其保存在高比例有机相，如90%甲醇/水体系中为宜。

2.3 三重四极杆质谱

2.3.1 离子源

质谱在工作过程中为了减少高速电子和离子与其他分子之间碰撞导致的能量消耗，离子必须处于高真空状态。因此维持离子源及质量分析器的高真空度是保证质谱仪能够正常运行的必要条件。机械泵的状态直接关系到离子源的真空度能否达到既定要求。因此，应注意观察机械泵的泵油颜色是否变深，泵油的体积是否控制在距离刻度线约三分之二处。每隔三年或者泵油颜色变深变暗时更换泵油为宜。应每日进行离子源流路清洗。每周进行离子源内腔清洗以及机械泵油量检查。每月进行一次机械泵滤网清洁，每年进行一次仪器除尘工作。除此之外，当喷雾针堵塞时应及时更换，当仪器灵敏度或者分辨率下降时应进行离子参数的优化。

2.3.2 质量分析器

四极杆质量分析器是由四根平行的金属杆组成，四极上加的直流电压和射频电压比值通常是一个常数，代表仪器的分辨率[5]。四极杆质量分析器的灵敏度和分辨率也存在反比例关系，即提高分辨率的同时会降低其灵敏度[6]。当仪器在正常工作时只要改变直流电压和射频电压值而不改变其比值，就能实现不同质核比的离子检测。当仪器长时间工作或者进行多种分析化合物测定后，通常会导致质量数或多或少的偏差，造成质谱仪灵敏度下降，因此，应定期进行仪器的校正，防止质谱质量轴偏差，造成测试结果的不准确。

3 常见故障排查

3.1 色谱图异常

一般情况如泵引起的脉冲或者梯度洗脱可能造成色谱图背景高，此时需要优化梯度洗脱条件。除此之外流动相污染时可观察到背景随着流动相梯度变化而变化，有时还会“出峰”，此时需要更换流动相，改用级别更高的溶剂。当离子源污染时，可观察到背景信号稳定，基本上不随流动相梯度变化处理，此时需要清洗离子源，包括内腔、喷雾针尖端。当前几个情况都处理过后，可尝试更换管路或/和喷雾针等。当交叉污染发生时，可观察到色谱图空白也出峰，一般为进样器污染。需要更换合适的样品清洗液，此清洗液应能溶解样品并将其从进样针上洗掉。然后进行进样针及进样针座的清洗。

3.2 系统压力异常

当系统压力波动，呈“锯齿”状。可能是溶剂未脱气，系统引入了气泡。需将流动相进行脱气，并排清仪器体系中的气泡。除此之外，泵密封圈的老化也会造成系统压力的波动。当系统压力偏低，此时需逐一排查如溶剂进口过滤芯是否被堵、色谱柱两端是否拧紧、色谱柱固定相是否流失、与质谱连接处管路是否漏液。当系统压力偏高，此时需检查系统中是否存在不溶性颗粒。将色谱柱拆下换上二通后观察压力是否正常。若压力值在正常范围内，则考虑为色谱柱堵塞。将色谱柱进行冲洗，完成后重新安装测试，若压力值较之前差别过大，则需更换色谱柱。将色谱柱拆下换上二通后观察压力若仍然偏高，则考虑进样针堵塞可能性较大。可将进样针切换至旁路，此时压力若明显下降，需要拆下进样针，用50%异丙醇浸泡超声清洗。

3.3 仪器污染处理

3.3.1 流动相污染

一般流动相的污染，特别是水相较容易污染，长时间放置会出现发霉长菌的情况，因此水相要选用一级水且现配现用。当流动相污染时，首先观察到的是信号采集时的背景较高，也就是基线较高。需要更换干净的流动相，或者是更换更高级别的流动相，一般有机相推荐质谱级、色谱级的有机相需用0.22 μm的滤膜过滤后使用。

3.3.2 色谱柱污染

当仪器检测空白样品时基线过高，并且有响应较高的色谱峰出现时，排除了流动相污染的情况下，色谱柱的污染可能性很高。当在检测过程中样本量过大或者样本浓度过高都会导致化合物在色谱柱中残留。如果流动相用到盐类，则需要先用10%的甲醇/水低流速进行冲洗，然后再换高比例甲醇过夜进行冲洗。否则可直接选择用高比例甲醇低流速过夜冲洗。

3.3.3 离子源污染

当检测的化合物浓度过高或者样本量过大都会导致离子源污染。质谱的工作时间过长会导致非带电残留物污染离子源，这些污染物很难通过离子源的高速电磁场，也不能进入真空系统。离子源被污染形成的静电涂层会引起电压响应行为的改变，因此仪器的灵敏度会降低。为预防质谱噪声高、信号不稳定，应每周进行一次离子源内腔，喷雾头与喷雾针尖端的清洗。一般先在软件中将质谱仪设置成待机模式，然后取下离子源，水平取出气帘板(curtain plate)，用无尘纸蘸取50%甲醇/水擦拭内外表面，氮气吹干。然后用甲醇湿润的无尘纸沿一个方向擦拭锥孔板(orifice plate)外表面(需关机)。一张纸擦拭一次，擦拭三次，擦拭完后注意检查锥孔中是否有纤维残留。根据质谱的运行时间和样品量种类，1～2周用50%甲醇/水擦拭离子源部腔体可降低数据图谱背景信号。在没有气帘气(curtian gas)输入时，为了防止仪器吸入室内空气污染内部离子传输元件，质谱主机最好关机，质谱关机时，保持氮气供应，可以防止离子轨道受潮。

4 结语

液质联用技术是用于检测分析的重要手段。液质联用仪器是属于贵重精密仪器设备。目前已面向南京中医药大学全体师生开放，在日常的管理过程中，为避免出现仪器的损毁，保证仪器高效公平的为全校师生的教学科研提供服务，需要严格管控仪器的预约、样品前处理、色谱柱维护、离子源及质量分析器的保养等工作。建立良好的管理方法，及时进行仪器的保养与维护能够提高液质联用仪器使用效率，节约分析时间，降低耗材成本，能够得到可靠的分析数据。