多巴胺表面修饰角蛋白/聚乳酸纳米纤维膜的制备及性能

王喜倩，尹国强，2，郭清兵，何明

（1 仲恺农业工程学院化学化工学院，广东 广州 510225；2 广州市农用化学品高效利用重点实验室，广东 广州 510225）

角蛋白作为一种天然可再生的生物材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，其分子结构中含有促进动物细胞黏附、增殖的氨基酸序列并能促进伤口愈合，故在医用伤口敷料领域拥有巨大的开发潜力。传统的伤口敷料旨在覆盖伤口表面，而良好的伤口敷料需具备优良的透气性、吸收性、无创性和安全性。通过静电纺丝技术可制备比表面积大、孔隙率高、孔尺寸均匀，具有良好的透气性的纳米纤维膜。但由于角蛋白可纺性差，需加入高分子聚合物与其混合才能制备纳米纤维膜。常用的高分子聚合物有明胶、聚乙烯醇、聚氨酯和聚己内酯等。聚乳酸（PLA）是一种新型的生物降解材料，具有良好的可纺性和力学性能，将聚乳酸与角蛋白共混不仅能解决角蛋白可纺性差的问题，还能提高其力学性能。尽管如此，角蛋白与聚乳酸共混制备的纳米纤维膜在力学性能和细胞活性方面还是存在不足。

多巴胺（DA）是内源性含氮有机化合物，对人体无害，且含有较多活性基团，能与角蛋白的侧链基团发生化学反应，同时多巴胺的自聚、表面修饰与黏附作用不仅能弥补了PLA 等高分子聚合物无生物活性的缺点，提高材料细胞的亲和力及组织黏附力，还能提高复合材料的机械性能。

1 实验

1.1 实验材料与仪器

羽毛角蛋白（FK），实验室自提取，具体实验细节参照参考文献[16]。鸡羽毛，广州市场收集的新鲜鸡羽毛；过氧乙酸，分析纯，天津福晨化学试剂厂；氢氧化钠，分析纯，天津大茂化学试剂有限公司；PLA，=300000，美国Nature work 公司；DA，98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；六氟异丙醇，分析纯，上海麦克林生物科技有限公司。人皮肤成纤维细胞（HSF）专用培养基，生物学级，上海赛百慷生物；磷酸缓冲液（PBS），生物学级，Procell；胰蛋白酶，生物学级，Biosharp；二甲基亚砜（DMSO），生物学级，天津富宇精细化工有限公司；噻唑蓝（MTT），生物学级，北京索莱宝科技有限公司；4,6−二脒基−2−苯基吲哚（DAPI），生物学级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。ET−2535DC 型静电纺丝机，北京永康乐业科技发展有限公司；UV 灯，龙光固24W，广州市豪斯发五金有限公司；扫描电子显微镜，EVO18，德国蔡司公司；傅里叶变换红外光谱仪，Spectrum100， 美 国PE 公 司； 热 重 分 析 仪，TG209F1，德国NETZSCH 公司；接触角测量仪，DSA100，德国KRUSS 公司；电子万能试验机，CMT6503，美特斯深圳工业有限公司；CO恒温培养箱，WIGGENS WCI −180，北京桑翌实验仪器研究所；超净工作台，SW−CJ−2FD，上海笃特科学仪器有限公司；酶标仪，SPARK 10M，TECAN；激光共聚焦显微镜，LSM880，ZENISS。

1.2 FK/PLA纳米纤维膜的制备

按照质量比为3∶7 分别称取0.48g FK 和1.12g PLA 于溶样瓶中，向溶样瓶中加入六氟异丙醇溶液，并定容至20g。配液完成后，将溶样瓶置于37℃恒温水浴锅中连续搅拌12h，制备得到FK含量为8%的FK/PLA 混合纺丝液。本实验采用ET−2535DC型静电纺丝机，将纺丝液装入带有22号针头的注射管，设置电压为20kV、流速为0.6mL/h、接收距离为12cm 的纺丝参数下以锡纸接收持续纺丝，制备具有一定厚度的FK/PLA纳米纤维。

1.3 多巴胺表面修饰FK/PLA纳米纤维膜

取一定量的DA 溶于去离子水中，并用1mol/L氢氧化钠调节pH 为7.0，制得浓度分别为0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L的DA溶液。

将上述静电纺丝制得的FK/PLA 纳米纤维膜浸渍于不同浓度的新配的DA溶液中，在35℃恒温水浴锅下用波长为365nm的UV灯照射3h。3h后撤去UV 灯，继续在35℃恒温水浴锅里静置反应3h。3h后取出纳米纤维膜，用去离子水反复冲洗3次，洗净后将纳米纤维膜置于温度为25℃、相对湿度为57%的恒温恒湿箱中烘干，烘干后得到聚多巴胺（PDA）改性的FK/PLA纳米纤维膜。

1.4 结构表征与性能测试

扫描电镜（SEM）：采用扫描电子显微镜观察改性前后纳米纤维膜的微观形貌，加速电压为15kV。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）：采用衰减全反射模式（attenuated total reflection，ATR）对膜样品、粉末样品进行测定，扫描范围为4000～600cm，分辨率为4cm，扫描次数为8次。

热重分析（TGA）：称取3～5mg 的膜样品，在氮气环境下，升温速度为10℃/min，测量温度范围为室温至700℃。

接触角实验：溶剂选用去离子水，选取滴落2s 时水滴与膜样品间左右两侧接触角的平均值作为评价标准。

力学性能测试：试样尺寸为1cm×6cm，拉伸速度设定为10mm/min，夹距为40mm，按照GB/T1040.3—2006标准执行。

1.5 生物相容性

1.5.1 细胞活性毒性测试

采用MTT 比色法，以HSF 作为实验细胞对表面修饰前后膜样品的生物相容性进行评价。将膜样品裁剪成直径为0.6mm的小圆片，将200μL的细胞悬液和培养基接种在膜样品上，进行细胞活性检测；将膜样品裁剪成10mm×10mm 的方块，置于2mL 的离心管中，并加入一定量的DMEM 培养液，得到不同DA 浓度浸泡的FK/PLA 纳米纤维膜的浸提液。取一定量的浸提液，并加入200μL/孔的HSF细胞悬液和培养基，进行细胞毒性检测。通过式(1)计算细胞相对增殖率。

式中，OD为待测样品在测试波长为570nm下的吸光度；OD为阴性对照组的吸光度。

1.5.2 细胞黏附性（DAPI染色）

DAPI 可以快速进入活细胞并与DNA 结合而发出荧光，在显微镜下采用波长为405nm的激发光激发可以使细胞核呈蓝色。所以通过DAPI 染色可以观察到材料表面活细胞的数目，并作为进一步评价材料的细胞黏附性与生物相容性方法。

以HSF 作为实验细胞。将膜样品裁剪成能够平铺在24 孔板底部的大小，裁剪后的膜样品正反面均进行紫外照射30min的灭菌处理，向装有膜样品的24 孔板的每个孔中准确加入1mL 的HSF 细胞悬液和培养基，置于5% CO、37℃恒温培养箱中培养24h 后，进行DAPI 染色，染色后置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

2 结果与讨论

2.1 FK/PLA纳米纤维膜的SEM图

图1 为FK/PLA 与UV 照射不同浓度DA 溶液浸泡修饰的FK/PLA纳米纤维膜在SEM下观察到的纤维形貌图，图2为采用Image pro plus软件对其纳米纤维直径进行统计得到的纤维平均直径图。从图中可以看出，未经PDA溶液浸泡改性的FK/PLA纳米纤维形貌相对均匀光滑，且纤维笔直，纤维间结构规整、较为松散，而经PDA 溶液浸泡修饰的FK/PLA纳米纤维形貌发生了明显的变化。具体表现在随着DA浓度的增加，纤维表面逐渐粗糙且纤维出现了弯曲，纤维与纤维间亦出现了黏合、重叠和缠绕现象，整体形貌变得较为紧密。这是因为UV照射DA 溶液引发其聚合生成PDA，PDA 具有黏附性，黏附在纳米纤维的表面使其表面粗糙，并且纤维与纤维间表面的PDA 相互黏结使得纳米纤维间发生黏合、重叠、缠绕。特别地，当DA浓度大于1.5g/L时，纤维表面的颗粒聚集增加，大量的颗粒黏附在纤维表面致使纳米纤维膜的孔隙减少。这是因为随着多巴胺浓度的增加，UV 照射后生成的PDA 的含量亦升高，大量的PDA 沉积覆盖在纳米纤维膜上。由此可见，DA 溶液表面改性后的纳米纤维膜其纤维平均直径均大于FK/PLA 纳米纤维膜，并且纤维平均直径随着DA 浓度的升高而增大。

图1 不同浓度DA溶液浸泡的FK/PLA纳米纤维膜的SEM图

图2 不同浓度DA溶液浸泡的FK/PLA纳米纤维膜的平均直径图

2.2 K/PLA纳米纤维膜的FTIR谱图

如图3(a)，对于PDA 修饰的FK/PLA 纳米纤维膜，在FTIR谱图可以观察到其与未改性的FK/PLA纳米纤维膜存在变化。2946cm原归属于PLA 的特征吸收峰变化成2921cm和2852cm特征吸收峰，它们对应于脂肪族—CH拉伸振动，该特征峰来自PDA 分子的烷基侧链。如图3(b)原FK/PLA在1245cm处羧酸的C—O 伸缩振动经PDA 改性后在1256cm出现新的吸收峰，该峰对应于芳香族C—N 伸缩振动。而此处出现的芳香族—NH来源于多巴胺聚合生成的PDA。故PDA 分子成功地沉积黏附在FK/PLA 纳米纤维膜对其进行表面修饰。

图3 纯组分及不同浓度DA溶液浸泡的FK/PLA纳米纤维膜的FTIR图

2.3 FK/PLA纳米纤维膜TG谱图

不同浓度DA 溶液浸泡的FK/PLA 纳米纤维膜的热重分析图如图4 所示。从图中可以看出，FK/PLA 与PDA 表面修饰的FK/PLA 纳米纤维膜的热降解过程均分为三个阶段：第一阶段的质量损失出现在40～150℃，该阶段的质量损失来源于样品中的水分蒸发，其质量损失为2%～3%；第二阶段的质量损失出现在215～325℃，这阶段质量损失主要是因为样品中部分FK 和PDA 发生降解，该损失为6%～13%；第三阶段的质量损失发生在325～500℃，这部分的质量损失是由于PLA 和PDA 表面涂层的FK/PLA的分解，为80%～90%。

从热重图中获得的热性能数据如表1所示，其中为样品质量损失10%时温度，为降解速度最快时的温度（即DTA 峰值），当样品质量损失10%时，改性后的纳米纤维膜所需温度均高于原FK/PLA 纳米纤维，高27～39℃。结合图4(b)，在热降解的第二阶段中，原FK/PLA 纳米纤维的降解速率均大于PDA修饰的FK/PLA纳米纤维膜，而在第三阶段中，PDA 修饰的FK/PLA 纳米纤维膜的最大降解速率普遍高于FK/PLA 纳米纤维膜。这是由于PDA 修饰的FK/PLA 纳米纤维膜表面有大量的氨基和羟基，这些基团之间相互作用形成氢键，使得PDA 修饰的FK/PLA 纳米纤维膜热稳定性得到提升。对于样品的热降解率，FK/PLA 的热降解率为95.98%，而改性后的FK/PLA 热降解率均大于原FK/PLA，这是由于改性后FK/PLA中的PDA的分解而导致样品热降解率的升高。

表1 不同浓度DA溶液浸泡的FK/PLA纳米纤维膜的热性能分析结果

图4 不同浓度DA溶液浸泡的FK/PLA纳米纤维膜的TG及DTG图

2.4 FK/PLA纳米纤维的力学性能

图5为不同DA浓度溶液改性的FK/PLA纳米纤维的弹性模量和断裂伸长率，膜样品的厚度范围为0.11～0.13mm。结果表明PDA 修饰后FK/PLA 的弹性模量和断裂伸长率均有提高，如弹性模量从原来的10.08MPa 提高到14.45～18.40MPa，断裂伸长率从原来的61.00%提高到92.80%～112.50%。结合SEM，在宏观上PDA 表面修饰后覆盖在纤维表面，一方面增加了纤维的直径，另一方面由于PDA 的黏附性，使得纤维黏合、重叠和缠绕在一起，促使纳米纤维间的结构更为紧密，力学性能增加。而随着PDA 浓度的增加，纳米纤维表面覆盖的PDA 层厚度和杂乱度增加，由PDA 本身具有脆性，故降低了其力学性能。从微观上，PDA 分子有大量的酚羟基和氨基，这些基团与FK、PLA 相互作用，破坏了原FK 与PLA 之间的氢键使得FK 与PLA 的流动性得到改善，故增加了纳米纤维的断裂伸长率。随着纤维表面与纤维间覆盖沉积的PDA增加，限制了FK 与PLA 链段的流动性导致其断裂伸长率下降。

图5 不同浓度DA溶液浸泡的FK/PLA纳米纤维膜的弹性模量和断裂伸长率

2.5 FK/PLA纳米纤维的亲水性

图6是不同DA溶液浓度改性后FK/PLA纳米纤维膜的接触角图。结果表明，未经PDA修饰的FK/PLA纳米纤维膜的接触角为103.35°，亲水性较差；而经PDA表面修饰的FK/PLA纳米纤维膜的接触角减少，并且随着DA浓度的增加而逐渐减少。这是由于FK/PLA 经PDA 表面修饰后，纤维表面黏附、沉积的PDA 分子含有大量的羟基和氨基等亲水性基团，从而增加了膜表面的亲水性，良好的亲水性有利于细胞的黏附、增殖，使得接触角降低。

图6 不同浓度DA溶液浸泡的FK/PLA纳米纤维膜的接触角图

2.6 FK/PLA纳米纤维的生物相容性

2.6.1 细胞活性毒性测试

如图7(a)、(b)分别为不同DA 浓度改性的FK/PLA纳米纤维膜样品的细胞增殖活力，以此作为细胞活性的检测和不同DA 浓度改性的FK/PLA 纳米纤维膜样品浸泡液的细胞增殖活力，以此作为细胞毒性的检测。其中以HSF细胞接种在空白孔板上的增殖情况作为基准。

图7 不同浓度DA溶液浸泡的FK/PLA纳米纤维膜及其浸提液的细胞活力

对于膜样品，在接种24h 时，FK/PLA 的细胞增殖活力较空白孔板差，而PDA修饰的FK/PLA细胞增殖活性均优于空白孔板上的细胞增值活力。这表明PDA修饰的FK/PLA纳米纤维与HSF细胞生物相容性较好。随着DA浓度的增加，细胞增殖活力亦升高，其中当DA 为3.0g/L 时细胞增值活力达到最高，为221%。这是由于PDA 分子具有丰富的羟基和氨基，不仅能增加膜的亲水性和蛋白质吸附能力，还能有效改善并提高FK/PLA 纳米纤维膜对HSF 细胞的黏附性，为细胞的生长和增殖提供支架。结合SEM分析，进一步升高DA浓度后，由于覆盖的PDA 过多减少了纳米纤维膜的空隙，导致细胞可黏附生长的区域减少，并且PDA 间相互黏附亦减少了细胞可黏附的PDA 数量，所以出现了细胞增殖活性降低的现象。在接种120h 时，细胞增殖活性较24h下降，这可能是由于膜样品在培养基中浸泡时间过长，PDA分子分解成DA，DA被氧化成多巴胺醌（DAQ）。DAQ 能与细胞的蛋白相互作用导致细胞醌中毒使细胞活性降低，进而导致细胞的增殖活力下降。

对于膜样品浸提液，接种24h时，由实验结果可见，浸提液的细胞增殖率与空白孔板对照组相接近，而接种120h时，原FK/PLA浸提液的细胞增殖率下降，而PDA修饰的FK/PLA浸提液的细胞增殖率亦发生了变化，大体表现趋势为随着DA浓度的增加，较原FK/PLA，膜浸提液的细胞增殖率升高。其中，当DA 浓度为1.5g/L、2.0g/L、和3.0g/L 时，浸提液的细胞增殖率大于对照组，此时，浸提液对细胞增殖有一定的促进作用。这可能是因为膜样品中的FK、PDA溶出，随着时间的推移，FK分解产生氨等有毒物质影响了细胞的活性，从而导致细胞的增殖率下降。而PDA 表面修饰的FK/PLA，由于PDA 覆盖在纤维的表面使得纤维中的FK 溶出量减少，并且伴随着少量PDA 的溶出，使得浸提液的细胞增殖率有小幅度的提高。

2.6.2 细胞黏附性

将HSF 细胞接种在膜样品上，利用DAPI 染色法观察黏附在膜样品表面的细胞密度。如图8 所示，PDA 修饰的FK/PLA 纳米纤维膜上的细胞密度均大于对照组和原FK/PLA，并且随着DA浓度的升高，膜表面细胞密度增大。这表明改性后的纳米纤维膜有良好的生物相容性，PDA 分子能提高细胞在膜表面的黏附性。

图8 不同浓度DA溶液浸泡的FK/PLA纳米纤维膜的荧光图

3 结论

用PDA 表面修饰FK/PLA 纳米纤维膜，分别对其微观形貌、结构及性能进行表征，以评价其作为皮肤伤口敷料的可能性，结果表明，经PDA 表面修饰后，由于PDA 具有黏附性，PDA 黏附在纳米纤维表面使得纤维间相互黏合、缠绕，提高了纳米纤维平均直径，并随着其浓度升高而逐渐增大。UV 引发了DA 氧化自聚，生成的PDA 分子成功黏附在了FK/PLA 纳米纤维膜表面。PDA 表面修饰后的FK/PLA 纳米纤维膜的热稳定性有所提高，并且亦提高了其热降解效率。经PDA 表面修饰后，纳米纤维膜的弹性模量和断裂伸长率均得到改善。膜表面的亲水性能提高。FK/PLA 纳米纤维膜经PDA表面修饰后更有利于HSF 细胞的黏附、增殖，其具有较好的细胞活性。但是随着时间的延长，由于PDA分解、氧化，使得细胞活性下降。

PDA 表面修饰的FK/PLA 纳米纤维膜不仅具有较好的力学性能，还有较好的细胞活性与细胞黏附性，故其作为皮肤伤口敷面材料具有潜在的可能性。