氧气辅助湿热预处理对玉米秸秆酒精发酵的影响

张强，陈诗阳

（长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022）

随着全球能源危机的不断加剧，生物质能源的研究引起了人们极大的兴趣。利用地球上成本低廉、数量巨大的玉米秸秆等纤维质原料生产燃料酒精的研究备受关注。玉米秸秆主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，它们通过化学键连接成牢固的网状结构，对相关的降解酶类具有较强的抗性，导致纤维素酶水解效率低下，因此秸秆酒精发酵首先要进行预处理。目前秸秆类物质进行预处理的方法大致可分为物理法、化学法、物理化学法及生物法。作为氧化剂，氧在碱性条件下可被还原为氧离子自由基（·O）以及羟基自由基（·OH）等，这些衍生的活性基团对木质素中常见的双键、芳香环等基团有较强的反应性，能够选择性地氧化降解生物质中的木质素，并且几乎不影响纤维素，因此在秸秆预处理过程中起着重要的作用。

本实验是在丹麦瑞素国家实验室所做的玉米秸秆湿热预处理实验基础上进行的，195℃、15min被认为是玉米秸秆最佳湿热预处理条件。本文在此基础上，加入氧气设置三种不同预处理条件，即条件1 （195℃，15min）、条件2 （195℃，15min，12bar O，1bar=0.1MPa）和条件3 （195℃，15min，12bar O，2g/L NaCO）对玉米秸秆进行预处理，对比氧气辅助预处理后玉米秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素含量变化以及纤维素酶解葡萄糖收率，并对预处理后抑制剂对酒精发酵的影响进行研究，以期为纤维质原料预处理及酒精发酵技术提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 玉米秸秆

玉米秸秆首先经过气流干燥，然后粉碎并筛分成1mm备用。

1.2 氧气辅助湿热预处理实验

实验采用丹麦瑞素国家实验室2L 环型高压容器进行。取60g处理好的玉米秸秆加入1L水，按照设置条件进行湿热预处理实验，然后将处理液过滤为固体滤饼及水解液两部分。

1.3 原料玉米秸秆及预处理后固体滤饼组成分析

首先称取0.16g 样品，用1.5mL 72% HSO于30℃水解1h，然后加42mL 蒸馏水及标准样品，121℃水解1h 过滤，糖的含量可由HPLC 测得，固体残留物经过干燥及称重可计算出木质素的含量。

1.4 预处理后水解液成分分析

湿热预处理后所得的水解液用80g/L HSO在121℃下水解10min，糖的含量（葡萄糖及木糖等）可由HPLC测得。

1.5 纤维素酶解葡萄糖实验

首先将预处理后干燥的原料粉碎，称取110mg样品加入0.2mol/L柠檬酸缓冲溶液（pH=4.8），加入纤维素酶（L）30FPU/DM（干重），50℃反应24h，水解后样品于4000r/min离心10min。

纤维素酶解葡萄糖收率（ECC）计算如式(1)。

式中，为酶水解后的D−葡萄糖浓度，g/L；为总体积，L；为酶水解之前纤维素的质量，g。

1.6 同步糖化发酵（SSF）实验

预处理后的玉米秸秆固体部分与水解液的质量比为8%（水解液预先用5mol/L NaOH 调整到pH 4.8）。首先在50℃进行24h预水解，加酶量10FPU/g（秸秆干重），然后再加入纤维素酶20FPU/g，同时加入0.2g 干酵母和0.2mL（24%）尿素，发酵在32℃进行。发酵完成后发酵液于3000r/min 离心处理10min，酒精浓度、糠醛及乙酸等抑制剂皆通过HPLC进行检测，结果为三次实验平均值。

1.7 液相色谱（HPLC）分析

色谱柱为Aminex HPX−87H （BIO−RAD），温度63℃，流动相为4mmol/L HSO，流速0.6mL/min，检测器为日本Shimadzu公司生产。

1.8 计算

纤维素及半纤维素的回收率计算如式(2)、式(3)。

2 结果和讨论

2.1 不同加氧预处理条件对玉米秸秆组分的影响

采用上述三种条件对玉米秸秆进行预处理，预处理后分为固体滤饼与水解液两部分。纤维素主要存在于固体滤饼中，而半纤维素主要存在于水解液中，化学组成发生了明显变化。从表1 和图1 可见，与原料玉米秸秆相比，玉米秸秆经过三种条件预处理后，固体滤饼中主要为纤维素，而半纤维素含量明显减少。固体滤饼中纤维素质量分数分别为55.9%、74.7%和73.3%，半纤维素质量分数分别为9.5%、7.1%和4.9%，而木质素质量分数分别为25.2%、17.5%和13.7%。水解液中纤维素含量较低，半纤维素含量较高。经计算，预处理后纤维素总体收率分别为91.2%、94.6%和95.9%，而半纤维素总体收率分别为74.5%、50.3%和68.2%。从以上数据分析中可知，3种预处理条件下，纤维素收率都比较高，平均在90%以上，而且纤维素绝大部分都保留在固体中，表明加氧预处理对纤维素收率影响不大。但是预处理过程中碱液NaCO能够削弱纤维素和半纤维素之间的氢键及皂化半纤维素和木质素分子之间的酯键，对纤维素起缓冲保护作用形成碱化纤维素，导致纤维素溶胀不易被破坏。另外与使用强碱性物质NaOH 等相比，NaCO能够减少对环境和设备伤害和腐蚀，也能改善微生物发酵效果，因此经过条件3预处理获得了更高的纤维素收率。而半纤维素收率变化较大，主要由于大部分半纤维素发生了溶解或降解，O的加入促进了半纤维素的溶出，所以经过预处理条件2 和条件3 后半纤维素无论从固体滤饼中的含量还是从总收率来看都低于条件1。

表1 预处理后玉米秸秆化学组成（质量分数）单位：%

图1 不同预处理条件下固体滤饼中各部分组成

木质素是由苯丙素类单体构成的无定形态高聚物，结构中包含大量苯环、双键等不饱和结构。在条件1湿热预处理过程中，半纤维素发生脱乙酰基反应，形成乙酸等酸性物，导致半纤维素的酸性降解和水解。由于弱酸处理不能有效脱除木质素，因而湿热预处理后玉米秸秆的木质素相对含量较高，木质素残留量达到25.2%。氧在反应过程中产生的氧离子自由基（·O）以及羟基自由基（·OH）等能够对木质素中的双键、芳香环等基团有较强的反应性，从而造成木质素和木聚糖的共价连接被破坏而成为水溶性成分，而且较高的氧气压力更有效，能够明显提高木质素的分解速率，所以经过有氧预处理能够明显降低木质素含量。加入碱性物质NaCO能使木质素中的酚羟基和烯醇基变为更有活性的酚盐和烯酮盐，能够加快氧的反应速度，促进木质素降解，因此采用预处理条件3后木质素最低含量降为13.7%，可见氧气和碱协同作用更有利于木质素的去除。

2.2 葡萄糖收率

采用葡萄糖收率来评估玉米秸秆预处理的效果。葡萄糖主要来自于玉米秸秆预处理后固体滤饼中纤维素的酶解，另外预处理过程中纤维素降解也会产生少量的葡萄糖。纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖是生产酒精的关键。从图2 可以看出，经过条件3 处理后的葡萄糖总收率达到73.5%，高于经条件1 和条件2 处理的69.4%和72.1%。其中三种处理条件下的葡萄糖酶解率分别为64.8%、65.8%和67.6%，远高于未经预处理的原料玉米秸秆的16.2%。可见预处理破坏了玉米秸秆的致密结构，提高了纤维素酶的酶解效率，从而获得了较高的葡萄糖收率。在木质纤维素原料中，纤维素降解性能与木质素含量密切相关，纤维素降解性能越好，原料中木质素含量越低，主要由于木质素可以吸附部分纤维素以及对纤维素酶具有一定的物理屏障作用。因此木质素被认为是影响纤维素酶水解的主要障碍，消除或减弱木质素的阻碍作用是提高纤维素水解效率的关键，因此经过条件3处理后获得了最高的葡萄糖收率。

图2 不同预处理条件下葡萄糖收率

2.3 抑制剂对酒精发酵的影响

玉米秸秆在湿热预处理过程中主要产生了两类抑制剂：一类是以糠醛为代表的醛类抑制剂，主要由己糖和戊糖在酸性环境下脱水生成；另一类是以乙酸为代表的羧酸类抑制剂，乙酸由半纤维素脱乙酰生成。本研究主要测定了三种预处理条件下水解液中糠醛和乙酸的含量，见表2。从表2 中可以看出，由于O的加入促进了半纤维素的溶出，半纤维素发生脱乙酰基反应会形成乙酸等酸性物质，所以采用加氧预处理后乙酸的含量会有较为明显的升高。从图3可知，随着发酵进行，乙酸浓度缓慢增加，主要因为所使用的酿酒酵母中含有少量乳酸菌，代谢部分木糖会产生少量乙酸，通过酸化作用使细胞生长受到抑制。通常乙酸浓度达到2g/L可引起菌体数量下降，达到4g/L 可引起酒精产量下降，但较低的浓度则不会对发酵产生明显的影响。糠醛主要由己糖和戊糖在酸性环境下脱水生成，所以采用加氧预处理后酸性条件下糠醛的含量也会有较为明显的增加。醛类化合物主要会抑制酵母生长，使发酵过程出现迟滞期。糠醛浓度一般达到1g/L 会对酵母产生抑制作用，另外酵母菌也能够代谢或降解部分糠醛等物质，利用迟滞期进行脱毒作用，所以从图3中看到，随着发酵进行，糠醛浓度会逐渐降低。

图3 发酵过程中抑制剂浓度的变化

表2 水解液中主要抑制剂的组成

采用酿酒酵母对湿热处理后的玉米秸秆固体与水解液混合液（底物浓度为质量分数8%）进行同步糖化发酵（SSF）实验，同时以原料玉米秸秆作为对照，结果如图4。从图4 可知，142h 发酵，经过条件3处理的玉米秸秆酒精产量达到25.0g/L，高于条件1和条件2下的17.2g/L和24.3g/L，而原料玉米秸秆酒精浓度仅为4.2g/L。另外从图4 也可以看到，经过加氧预处理的玉米秸秆发酵液在4h 左右会出现由于醛类物质作用短暂出现的迟滞期，由于发酵液中糠醛浓度均较低，所以抑制作用并不明显，随后酒精浓度迅速增加，经过条件3处理的玉米秸秆酒精发酵液最终获得了25.0g/L 的最高酒精产量。

图4 发酵过程中酒精浓度变化

3 结论

采用三种不同氧气辅助湿热预处理条件处理玉米秸秆：条件1（195℃，15min），条件2（195℃，15min，12bar O），条件3（195℃，15min，12bar O，2g/L NaCO）。实验结果表明：经过条件3 处理的玉米秸秆纤维素收率和葡萄糖收率最高，分别为95.9%和73.5%，并且利用酿酒酵母，在底物浓度为质量分数8%时，经过142h发酵，获得最高酒精浓度25.0g/L，发酵过程没有明显的抑制作用发生。以上实验结果表明，氧气辅助湿热预处理玉米秸秆过程中，氧气主要与木质素发生反应，降低了木质素含量，尤其与碱性物质碳酸钠（NaCO）结合，有效提高了纤维素收率和纤维素酶解效率，最终获得了较高的酒精收率，而且发酵过程中没有明显的抑制作用发生。