结直肠癌肿瘤组织中TMPRSS4、c-Met、KIF18A表达水平与其病理特性和生存状态的关系

雷新键，杨千洪，郑款恒，李 瑾，李 峰

宁德师范学院附属宁德市医院肿瘤外科，福建宁德 352200

流行病学调查显示，结直肠癌的发病率为25.84/100 000[1]，其发病率仅次于肺癌及乳腺癌。随着我国居民生活方式及饮食结构的改变，结直肠癌的发病率及病死率呈现逐年上升趋势，但是结直肠癌的早期症状不典型，患者在确诊时往往已处于中晚期，所以在临床治疗中，及时有效地对结直肠癌进行诊断，对预后具有积极意义[2]。结直肠癌的发病机制较为复杂，目前统一的认知认为，基因的突变、肿瘤细胞的侵袭、转移及逃离自身免疫系统检查对于肿瘤的发展具有重要意义。跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSSs)参与细胞外介质的降解，可促进细胞在组织内的迁移及扩散，从而促进肿瘤细胞的远处转移播散[3]。间质表皮转化因子(c-Met)是重要的受体酪氨酸激酶，其表达的过度激活会造成正常细胞向肿瘤细胞的转化，进一步促进肿瘤细胞的侵袭[4]。驱动蛋白家族成员18A(KIF18A)属于驱动蛋白超家族中的重要成员，在机体的微管末端发挥重要的解聚酶作用，进而影响肿瘤的进展[5]。本研究主要通过研究结直肠癌肿瘤组织中TMPRSS4阳性率、c-Met阳性率及KIF18A水平与患者病理特性和生存率的关系，进而对患者的临床诊断提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2015年3月至2017年6月确诊的102例结直肠癌患者作为研究对象，平均年龄(45.44±7.44)岁；男67例，女35例；体质量指数(23.52±1.59)kg/m2；临床TNM分期：T1～T2期50例，T3～T4期52例；临床分型：肿块型45例，溃疡型32例，侵袭型25例。所有患者均签署知情同意书，并经医院伦理委员会论证通过。纳入标准：(1)符合结直肠癌诊断标准[6]；(2)入院前未进行抗肿瘤治疗；(3)无肿瘤远处转移；(4)已获得知情同意。排除标准：(1)严重心脏、肝、肾功能障碍；(2)入院前3个月服用过糖皮质激素或受体拮抗剂类药物；(3)中途停止治疗或者转院。

1.2研究方法 本研究在对患者的治疗中，及时对患者的癌变组织及癌旁正常组织(距离病灶部位2 cm以上)进行收集。在对患者组织的收集过程中，遵循知情自愿原则。

1.2.1TMPRSS4、c-Met水平检测 对患者的病灶组织进行常规脱蜡处理后，采用DAB进行显色及复染，使用已知的组织切片作为参照，对患者的TMPRSS4、c-Met蛋白水平进行检测。根据患者细胞质内出现棕黄色及棕褐色颗粒的数量计算阳性率。在TMPRSS4、c-Met切片的两个视野进行随机检测，阳性率<10%为0分，阳性率为10%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分，两个视野的评分乘积为免疫评分，以其评分≤2分为阴性，评分>2分为阳性[7]。

1.2.2KIF18A水平检测 使用Trizol试剂，按试剂盒说明书从机体病灶组织提取总RNA，匀浆后依次加入Trizol、氯仿、异丙醇及75%乙醇抽提标本总RNA，获取RNA后使用反转录试剂盒中RNA保存液溶解，于-20 ℃保存。向总RNA中先后加入去除gDNA的DNA eraser及反转录酶，按说明书配制成20 μL的体系，在37 ℃条件下行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)15 min，在85 ℃的条件下维持15 s后终止。以反转录得到的cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR(qPCR)。以GAPDH的表达量作为内参。

1.3观察指标 比较癌变组织及癌旁组织TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平。分别对不同性别、年龄、病程、临床分型、TNM分期患者的TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平进行比较。对患者随访3年，以患者的死亡作为终点事件，比较生存组及死亡组患者TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平。

2 结 果

2.1癌变组织及癌旁组织TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平比较 癌变组织的TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平明显高于癌旁组织(P<0.05)。见表1。

表1 癌变组织及癌旁组织TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平比较

2.2不同病理组织TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平比较 不同性别、年龄患者TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而不同病程、TNM分期、临床分型患者TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同病理组织TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平比较

2.3不同生存状态TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平比较 通过对患者的随访，生存患者61例，死亡患者41例，生存组TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平明显低于死亡组(P<0.05)，见表3。

表3 不同生存状态TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平比较

2.4相关性分析 患者TNM分期、临床分型、病程及生存状态与TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平均呈正相关(r=0.165～0.998，P<0.05)，见表4。

表4 相关性分析

3 讨 论

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一。流行病学调查显示，结直肠癌患者的病死率在所有恶性肿瘤中排于第4位[8]。近年来，随着治疗方法及手术方式的不断改进，结直肠癌患者的生存率仍然不够理想[9]。而绝大多数患者在确诊时已发展为中晚期，因此，早期诊断并针对性治疗结肠癌具有重要的临床意义。

本研究通过对癌变组织及癌旁组织的TMPRSS4分析显示，癌变组织的TMPRSS4阳性率明显高于癌旁组织。通过对不同病理状态患者的TMPRSS4阳性率进行分析，随着机体病理状态的不断加重及生存状态的恶化，TMPRSS4阳性率明显升高。目前有研究发现，TMPRSS4能够干预胚胎发育及癌细胞的生长。有动物实验已经证实，在对动物进行TMPRSS4基因敲除后会导致动物的组织发育及细胞分化出现严重缺陷，进一步提示TMPRSS4黏附分子可参与器官的发育[10]。有研究显示，在肿瘤细胞中，癌变组织TMPRSS4水平明显高于癌旁组织，且TMPRSS4对肿瘤细胞的增殖具有调节作用[11]。此外，TMPRSS4可通过抑制转录抑制因子分泌影响E-cadherin的表达，进一步促进结直肠癌患者肿瘤细胞的不断侵染。同时，TMPRSS4可以激活黏着斑激酶和细胞外信号调节激酶等下游转导通路，让癌细胞侵袭性增加。而在本研究中，癌变组织的TMPRSS4阳性率明显升高，提示肿瘤的增殖能力明显提高。廖和强等[12]发现，TMPRSS4水平随着患者肿瘤细胞侵袭性的增强呈现明显升高趋势，这揭示了TMPRSS4水平可以用于预测结直肠癌的侵袭转移能力。

本研究结果显示，随着患者病理状态的加重及生存状态的恶化，其c-Met阳性率明显升高，c-Met主要参与了结直肠癌患者肿瘤的扩散。有研究认为，人类的c-Met基因主要通过编辑跨膜受体，进而产生自身磷酸化的活性。通过自身的磷酸化及活化信号的转导，下游中间体发生自身磷酸化，这在一定程度上提高了细胞的运动能力[13]。而肿瘤细胞随着自身的运动能力提升逐渐向内皮细胞和上皮细胞分散，增加了其侵袭性。同时，c-Met在一定程度上对新生血管的生成具有诱导作用，进一步增强了肿瘤细胞的侵袭能力，导致患者的预后较差。在本研究中，癌变组织的c-Met阳性率明显高于癌旁组织，提示局部病灶部位的微血管密度呈现明显升高趋势，且患者肿瘤细胞随着血液循环向其他组织器官扩散的风险升高。张翔等[14]在对结直肠癌患者c-Met基因水平的分析中发现，患者的预后与c-Met水平呈负相关，而本研究也显示癌变组织c-Met阳性率升高，提示c-Met参与了结直肠癌的发生和发展。

KIF18A主要参与了细胞器及染色体转运，在细胞的有丝分裂中发挥重要作用。有研究报道，KIF18A在运动过程中可沿着微管正极运动[15]。且在运动过程中，可在微管的末端发挥解聚酶作用。而微管的长度在一定程度上决定了其解聚能力。在正常人体细胞分裂过程中，若KIF18A水平异常升高，会造成有丝分裂过程出现异常，导致出现大量的非整倍体，诱导正常细胞转变为肿瘤细胞。有研究发现，KIF18A水平与细胞周期素b1的表达量相似，KIF18A水平明显升高可能提示患者的预后能力较差[16]。本研究中，死亡组的KIF18A水平明显高于生存组。提示随着患者KIF18A水平的升高，肿瘤细胞的分裂能力明显提高，这对患者的预后具有消极作用。李斌等[17]在对肿瘤细胞KIF18A水平的分析中发现，患者的KIF18A水平与生存关系存在显著相关，提示KIF18A可作为结直肠癌病情进展的重要参考。

综上所述，结直肠癌肿瘤组织中TMPRSS4、c-Met阳性率及KIF18A水平与患者病理特性和生存率存在一定的相关性，可作为结直肠癌诊断的辅助参考之一。