KIF14在肝细胞癌SMCC-7721获得性耐药机制中的研究

王宗文 李小东 朱乾坤 曾世聪 翟博

原发性肝癌是世界上第六大常见癌症，其起病隐匿、发展迅速、致死率高。据统计肝癌在男性癌症死亡原因中排第二，是我国癌症患者的第三大死亡原因，其中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)约占原发性肝癌的80%[1-2]。手术切除和肝移植是早期肝癌患者最有效的治疗方式，然而大部分患者在确诊时已经处于进展期阶段，丧失了根治治疗的机会，因此系统性的治疗在中晚期肝癌中扮演着极其重要的角色[3-4]。目前，分子靶向治疗药物索拉非尼(Sorafenib)作为HCC一线治疗药物已广泛应用于临床。索拉非尼作为一种多激酶抑制剂，其作用靶点多样，通过作用于JAK/STAT、RAF/ERK/MEK、Wnt/β-catenin、VEGFR和PDGFR等通路，调节细胞自噬、促进肿瘤细胞凋亡、减少肿瘤血管生成，进而改善中晚期肝癌患者生存期；但随着患者长期应用索拉非尼治疗，索拉非尼的有效性降低和耐药率已引起广泛关注[3-6]。据多项研究表明人类驱动蛋白家族成员14(KIF14)在包括HCC在内的多种癌症中表达上调，并参与调控肿瘤细胞的耐药[6-8]。本研究以人正常肝细胞LO2、肝细胞癌SMCC-7721及其相应的索拉非尼耐药细胞SMCC-7721-SR为研究对象，探讨KIF14在HCC对索拉非尼耐药中的作用及机制，为逆转肝癌在索拉非尼耐药中的治疗寻找新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常肝细胞LO2和人肝细胞癌SMCC-7721细胞株购于中国科学院上海细胞库。索拉非尼购于济南精合医药科技有限公司。凋亡检测试剂盒购于美国BD Biosciences公司。PCR相关试剂(TRIzol、PCR扩增试剂盒、Real-Time PCR试剂盒、cDNA逆转录酶)购于GENEWIZ生物技术有限公司。转染相关试剂siRNAs购于上海吉玛制药技术有限公司，Lipofectamine 3000TM转染试剂盒和OPTI-MEM购于美国Thermo Fisher公司。KIF14兔抗人多克隆抗体购于英国 Abcam 公司，β-actin 鼠抗人单克隆抗体和羊抗兔/鼠二抗购于北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

人正常肝细胞LO2和人肝细胞癌SMCC-7721细胞培养于含 10% 胎牛血清的 DMEM高糖培养液中(含有 1%的青链霉素双抗)，并置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中。采用浓度梯度递增法诱导SMCC-7721对索拉非尼的耐药细胞株并将其命名为SMCC-7721-SR，以索拉非尼0.5 μmol/L 为起始浓度开始培养，待细胞稳定生长后逐渐提高索拉非尼的浓度，每次提高0.25 μmol/L，直至细胞能在10 μmol/L的索拉非尼培养液中稳定生长。耐药细胞始终培养于含索拉非尼10 μmol/L的培养液中，以维持耐药细胞对索拉非尼的耐药特性。待细胞密度达到90%左右时，选取处于对数生长期的细胞，常规使用0.25%胰酶(0.02%EDTA)消化传代，进行后续实验。

1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

取对数生长期的LO2、SMCC-7721和SMCC-7721-SR细胞，根据试剂说明书用TRIzol提取总RNA。按照引物设计合成技术标准，结合文献设计合成 KIF14 基因引物，并以 GAPDH 作为内参，其相关序列如表1所示。将提取的总RNA采用逆转录试剂盒逆转录合成 cDNA，继而利用 Mx3000P实时PCR系统(Stratagene，USA)将从总RNA获得的逆转录产物加载到Taq Man阵列上，用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。通过解链曲线确认扩增的特异性，并使用GAPDH进行标准化，根据公式：CT值=2-ΔCT[ΔCT=CT靶基因-CTGAPDH]，用CT值计算KIF14的mRNA相对表达水平，重复三次实验并计算平均值。

表1 KIF14及GAPDH的引物序列

1.4 Western blot检测

取处于对数生长期的贴壁细胞，在用提前预冷的PBS缓冲液冲洗3次后根据试剂商说明书提蛋白。然后将30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，后将分离的蛋白质转膜至PVDF膜上。使用5%的脱脂牛奶(含0.1% Tween20的TBS缓冲液)封闭PVDF膜1 h，然后在4℃下与抗KIF14(1∶1 500)、β-actin(1∶2 000)的一抗孵育过夜，用TBST(含0.1% Tween20的TBS缓冲液)洗涤5次后，室温下二抗(1∶5 000)继续孵育2 h。然后用TBST冲洗5次，后在凝胶成像系统中，加入200 μL等体积混合的显色液A液和B液，观察抗体抗原复合物显色反应，以β-actin为对照。所有实验重复三次。

1.5 siRNA的设计、合成及转染

检索NCBI Genbank数据库，获取本研究中拟进行干预基因KIF14的基因序列。按照siRNA的设计原则，采用Invitrogen公司的RNAi express在线的设计软件，结合文献，设计针对KIF14及其无同源性的非特异性对照组双链siRNA序列，然后由上海吉玛制药技术有限公司合成实验所需siRNA双链。设计合成两条针对KIF14特异性的siRNA命名为siKIF14-1、siKIF14-2，阴性对照siRNA称为NC。它们的序列和相应的靶基因如表2所示。

表2 靶基因及序列

取处于对数生长期的SMCC-7721-SR以每孔5×105个细胞培养于六孔板中，培养24～48 h，待细胞生长到70%～90%融合后，按照操作说明书用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine 3000 TM和siKIF14或NC。然后将稀释的siKIF14或NC等体积加入到Lipofectamine 3000 TM中，获得50 nmol/L 作为siKIF14和NC的最终工作浓度。为验证siRNAs的有效性，通过Western blot分析相关蛋白的表达情况。接下来将相应的siRNAs转染肝癌细胞24～48 h，然后进行相应实验的细胞活力检测。以上实验重复三次。

1.6 CCK-8法测细胞活力

采用CCK-8试剂盒检测细胞活力，取对数生长期的LO2、SMCC-7721、SMCC-7721-SR或转染siKIF14的SMCC-7721-SR以 3×103个/孔的密度接种于 96 孔培养板中过夜，和/或与10μmol/L的索拉非尼孵育 24～48 h加入10 μL/孔CCK-8 溶液新鲜培养基然后在 37℃下孵育2 h，在酶联免疫检测仪测量450 nm处的光密度值。细胞活力(%)=(实验OD值-空白OD值)/(对照OD值-空白OD值)×100%。重复三次实验，计算平均值。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡，将siKIF14转染肝癌细胞和/或与10 mol/L索拉非尼于6孔板中孵育24～48 h，弃上清液，PBS重悬离心，用结合缓冲液悬浮细胞调节浓度为每毫升1×106个细胞，后抽取细胞悬液100 μL加至5 mL流式管中，加入5 μL的Annexin V-FITC混匀避光室温孵育10 min，然后再加入5 μL PI，混匀避光室温孵育5 min。接下来使用Beckman Coulter epics Altra II细胞仪检测细胞凋亡率。以上实验重复三次，计算平均值。

1.8 药物协同作用的评价方法

使用参考文献药物协同计算方法[6，9]，按公式计算药物相互作用指数(CDI)，CDI=AB/A×B。AB为联合用药细胞活力指数，A、B分别为各单药的细胞活力指数。当CDI>1两药作用性质为拮抗，CDI=1时两药作用性质相加，CDI<1时两药作用性质为协同，CDI<0.7则协同作用显著。

1.9 统计分析

2 结果

2.1 耐药细胞耐药性的验证

CCK-8法和凋亡检测结果显示，索拉非尼对SMCC-7721的抑制作用明显强于SMCC-7721-SR，在10 μmol/L索拉非尼作用48 h后SMCC-7721-SR细胞活力达(72±4)%，凋亡率为(29±3)%，而亲本细胞SMCC-7721几乎无存活，细胞活力仅为(31±4)%，凋亡率为(62±2)%。表明诱导建立的耐药细胞SMCC-7721-SR对索拉非尼出现明显的耐药性(图1)。

图1 耐药细胞耐药性的验证Figure 1 Verification of drug resistance of the drug resistant cellsNote：A.The effects of sorafenib on viability of SMCC-7721 cells and SMCC-7721-SR cells；B.The effects of sorafenib on apoptosis of SMCC-7721 cells and SMCC-7721-SR cells.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the corresponding SMCC-7721-SR cells.

2.2 KIF14参与肝细胞癌SMCC-7721索拉非尼的获得性耐药

在人正常肝细胞LO2和肝细胞癌SMCC-7721及SMCC-7721-SR中，qRT-PCR、Western blot结果显示与人正常肝细胞LO2相比，KIF14在肝细胞癌SMCC-7721表达增强(P<0.01)；与肝细胞癌SMCC-7721相比，KIF14在其耐药细胞SMCC-7721-SR也显著上调(P<0.01)(图2)。结果提示KIF14与肝细胞癌SMCC-7721索拉非尼的的获得性耐药相关。

图2 KIF14参与HCC的进程，调控索拉非尼的获得性耐药Figure 2 KIF14 was involved in the drug resistance of sorfenib in SMCC-7721 cellsNote：A.The expression of KIF14 at a mRNA level was measured in LO2 cells，SMCC-7721 cells and SMCC-7721-SR cells by qRT-PCR；B.The expression of KIF14 protein in LO2 cells，SMCC-7721 cells and SMCC-7721-SR cells；C.The density was normalized by β-actin.**P<0.01，***P<0.001.

2.3 抑制KIF14能够增强SMCC-7721-SR对索拉非尼的敏感性

为验证siKIKF14s转染的有效性，Western blot分析结果显示，与对照组相比，设计合成的siKIF14均能有效的下调SMCC-7721-SR细胞中KIF14蛋白的表达(P<0.05)，且siKIF14-2作用效果更好(图3A，3B)，故采用siKIF14-2进行后续实验。接下来，将siKIF14-2转染的SMCC-7721-SR耐药细胞和/或与10 mol/L索拉非尼单药或联合再培养，CCK-8法和凋亡检测结果显示SMCC-7721-SR耐药细胞接受单独索拉非尼或siKIF14-2敲除后，其相对细胞活力分别为(78±2)%和(71±3)%，联合作用后其相对细胞活力为(38±3)%，联合作用指数为0.686，表现出明显的协同作用(P<0.01)；应用索拉非尼或siKIF14-2敲除单独作用后其凋亡率分别为(27±3)%和(32±2)%，与索拉非尼或siKIF14-2单独作用相比，两者联合作用其凋亡率为(45±2)%(P<0.01)(图3C，3D)。以上研究结果表明抑制KIF14的表达能够增强SMCC-7721-SR对索拉非尼的敏感性。

图3 抑制KIF14能够增强SMCC-7721-SR对索拉非尼的敏感性Figure 3 Silencing KIF14 enhanced the sensitivity of SMCC-7721-SR cells to sorafenibNote：A.The expression of KIF14 protein in SMCC-7721-SR cells after knocking down KIF14；B.The density was normalized by β-actin；C.The effect of sorafenib synergistic KIF14 silencing on cell viability，the cell viability was compared with the control group；D.The effect of sorafenib synergistic KIF14 silencing on cell apoptosis.*P<0.05，**P<0.01.

3 讨论

近些年我国肝癌的发病率及死亡率呈上升趋势，给我国造成了沉重的经济负担[2]。索拉非尼是近十年来唯一获得美国食品和药物管理局(FDA)批准的对进展期肝癌系统治疗药物，但HCC对其耐药的问题颇为严重，患者的获益有限、预后较差，因此急需探索新的治疗方式[10]。自索拉非尼获批以来人们对索拉非尼的耐药机制进行了大量研究，索拉非尼在抑制肿瘤发生发展中通过阻断与血管生成相关的膜受体VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR从而阻断MAPK通路，起到抗血管形成作用。但血管萎缩引起局部组织缺氧从而诱发缺氧诱导因子1(HIF-1)的表达，HIF-1通过结合缺氧反应元件激活下游众多靶基因从而参与肿瘤侵袭、转移及化疗耐药等诸多环节[11-12]。PI3K/AKT通路是HCC索拉非尼耐药的关键通路，该通路通过参与调节上皮间质转化(EMT)促进肿瘤细胞的远处转移，在肝癌的发生发展中起着重要作用；阻断AKT通路会增加HCC对索拉非尼的敏感性，研究还发现PI3K/AKT通路的激活主要导致AKT磷酸化水平升高[3，12]。此外也有研究证明肿瘤干细胞、JAK-STAT通路、自噬通路均与HCC对索拉非尼的获得性耐药相关[6]。

KIF14是驱动蛋白超家族(KIFS)中的成员之一，位于染色体1q32.1上，通过调节有丝分裂纺锤体的形成、参与染色体的分离和胞质分裂的完成，从而促进肿瘤的发生发展[7]。有研究表明KIF14在乳腺癌、神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、胃癌、结直肠癌中表达上调，成为癌症的预后标志物和癌基因[7-8，14]。本研究中采用浓度梯度递增法建立HCC对索拉非尼的耐药细胞系，应用qRT-PCR及Western blot检测人正常肝细胞LO2、肝细胞癌SMCC-7721及其相应耐药细胞SMCC-7721-SR中KIF14的表达情况，结果表明肝癌细胞中KIF14表达上调，与肝癌亲本细胞相比在耐药细胞中KIF14表达更明显，推测KIF14可能参与调控HCC SMCC-7721对索拉非尼的获得性耐药，后续实验在耐药细胞中通过敲低KIF14，结果表明抑制KIF14可以增强SMCC-7721-SR对索拉非尼的敏感性，与我们先前在Huh-7和HepG2细胞系的研究有一致结果[6]。我们先前研究中证明了Huh-7和HepG2耐药细胞系中上调了KIF14和p-AKT的表达，并通过沉默KIF14下调p-AKT的表达从而促进肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞活力[6，15-16]。SMCC-7721-SR是否可通过沉默KIF14下调p-AKT增敏索拉非尼的疗效则需要进一步验证。

综上所述，本研究表明KIF14参与HCC的进程，调控索拉非尼的获得性耐药。KIF14表达上调是HCC细胞对索拉非尼耐药的原因之一，它的阻断与索拉非尼有协同作用。这些发现为抑制KIF14的表达作为索拉非尼治疗失效后的二线治疗靶点提供了依据，或与索拉非尼联合用药以增强HCC的抗肿瘤作用。