慢性乙型肝炎治疗的研究进展

李冰,王树文,程晓博,曹晔,刘艳,金银鹏

(复旦大学附属上海市公共卫生临床中心,上海 201508)

据世界卫生组织估计，2019年全球约有2.96亿人患有慢性乙型肝炎(CHB)，每年新增感染病例150万例，其中我国携带者人数为1亿，并以每年10万的速度增长[1-2]。1980年代至2000年初期，在乙型肝炎(乙肝)疫苗推广以前，我国5岁以下儿童乙肝病毒(HBV)感染率为5%，随着乙肝疫苗的推广，2019年HBV感染率降至1%。HBV持续感染会引起肝脏慢性炎性损害，持续半年以上转为CHB，其中约1/3为重症[3]。通过对乙肝e抗原(HBeAg)的检测，CHB又可分为HBeAg阳性和阴性CHB。乙型肝炎病毒(HBV)是目前已知能够感染人类的最小的双链DNA病毒，其DNA分子仅由3 200个核苷酸组成，编码乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和DNA多聚酶，其中HBsAg对诊断HBV感染具有重要的意义。虽然乙肝的发病机制尚未完全明确，但是研究表明HBV持续感染引发机体的免疫应答是导致肝损伤和炎症持续发生，使病情发展至肝硬化甚至恶化为肝癌的主要原因[4]。病毒复制周期机制的发现引导了新治疗药物的发展。本文对抗HBV药物及新的HBV治疗方案进行了总结，期望能为乙肝临床治疗提供参考。

1 乙肝的治疗现状

根据我国《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》和2022年最新《扩大慢性乙型肝炎抗病毒治疗的专家意见》以及2017年欧洲肝脏研究学会(EASL)指南[5]，HBV-DNA阳性、有乙肝肝硬化或乙肝肝癌家族史、年龄大于30岁，无论HBeAg水平如何，谷丙转氨酶(ALT)是否正常，都需要开始抗病毒治疗。其临床药物主要为干扰素(IFN)和核苷(酸)类药物(NAs)。

1.1 IFN

IFN由单核细胞和淋巴细胞产生，是一种能够通过刺激细胞因子、激活免疫调节而直接抑制HBV复制的可溶性糖蛋白，为最早应用于乙肝临床治疗的药物之一。根据半衰期的长短IFN可分为短效IFN和长效IFN。国内常用的短效IFN为IFN-α，该药通常应用于首次接受治疗并希望在短期内快速完成疗程的年轻及有生育要求的病人。长效IFN更适用于病程相对较长的病人。有研究表明，对于CHB病人，长效IFN聚乙二醇干扰素α(Peg-IFN-α)的症状改善率以及HBeAg、HBV-DNA阴转率显著高于短效IFN[6]。需要指出的是，IFN不宜在妊娠、肝衰竭及存在神经系统病变的情况下使用，其不良反应包括骨髓抑制以及内分泌系统、消化系统、神经系统症状[7]。

1.2 NAs

治疗乙肝的NAs主要有核苷类(拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦等)和核苷酸类(阿德福韦、富马酸替诺福韦酯、富马酸丙酚替诺福韦等)。在病毒的复制过程中，NAs模拟、取代延长聚合酶链的天然核苷(酸)，抑制逆转录酶和聚合酶，从而阻止聚合酶链的延长，起到抑制HBV-DNA复制的作用。虽然NAs抗病毒活性强、安全性高、临床应用广泛，但其耐药屏障低，耐药率高，并且易产生胃肠道反应、头痛和肾毒性等不良反应，因此不宜长期服用[8]。为最大程度减少药物副作用，新药的研发一直在进行。2021年批准上市的用于乙肝治疗的创新药艾米替诺福韦片是第二代替诺福韦，为替诺福韦的亚磷酰胺药物前体，是一种新型的核苷酸类逆转录酶抑制剂。相较于替诺福韦，艾米替诺福韦通过优化结构，拥有更高血浆稳定性，经肝细胞代谢，活性代谢产物双磷酸替诺福韦在肝脏高浓度聚集，从而实现肝靶向，提升了药物的利用度，能更快发挥抗病毒的作用，强效抑制HBV复制。该药只需要少于替诺福韦1/10的剂量便可获得相似的抗病毒效用，且对骨密度及肾脏影响较小。

2 抗乙肝新药的进展

由于现有抗病毒药物只能控制HBV复制而无法清除病毒，且面临耐药性产生的问题，因此全球的科研工作者仍在努力优化现有药物或挖掘新的治疗靶点以期阻断新的肝细胞感染，消除病毒cccDNA储存库，进而有效抑制病毒复制并最终恢复机体的正常生理功能。新的抗HBV靶标包括抑制HBV复制、降低和阻断HBV/丁型肝炎病毒(HDV)受体的钠离子-牛磺酸胆酸共转运蛋白(NTCP)表达、干扰HBV衣壳体的组装等，虽然这些基于新机制的抗HBV药物大多数仍处于临床试验期，但已有的研究表明，它们在抗病毒的有效性、安全性、耐药性、不良反应等方面要优于原有的抗病毒药物。

2.1 病毒进入抑制剂

Myrcludex B是一种合成型脂质肽，可通过阻断HBV与NTCP受体的结合来抑制HBV进入肝脏细胞。一项Ⅱb期临床试验表明，慢性HBV/HDV复合感染病人通过Myrcludex B与Peg-IFN-α联合治疗以后，HBsAg清除率高达27%，并且3/4的病人出现了血清HBsAg转阴[9]。

2.2 消除cccDNA储存库药物

沉默或者清除被感染肝细胞中的cccDNA储存库是另一种新兴的HBV治疗方法。cccDNA是包裹在转录活性和非转录活性染色质中稳定的非整合型微染色体，是核酸酶基因编辑的HBV最佳治疗靶标[10]。近来，定向诱变引起了极大的关注，此方法的原理是通过使用序列特异性RNA引导的核酸酶来编辑cccDNA使之永久沉默，从而治愈HBV感染病人。这类核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录活化剂样效应核酸酶(TALEN)以及CRISPR-CAS系统[11-14]。新型的分子cccDNA去稳定剂ccc_R08，能显著而持续地降低血清中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA和HBV-RNA的水平，并能降低HBV感染模型小鼠肝脏中cccDNA的水平[15]。

2.3 RNA干扰药物

HBV具有5个病毒mRNA转录子，其中任何一个被干扰均可使病毒抗原的合成出现障碍，因此，另一种潜在的治疗方法是RNA干扰。小干扰RNA(siRNA)属于双链RNA分子，长度为20～25个碱基对，可调节基因表达[16]。其中一条链与Ago2/RISC复合物相互作用而降解，另一条链则与互补mRNA结合，通过一种RNA诱导沉默的复合物的介导而使mRNA降解[17]。从理论上来说，这类化合物能够影响HBV-DNA、HBeAg和HBcAg的水平，从而逆转免疫力衰弱而激发有效的HBV特异性免疫，实现HBsAg血清转阴和功能性治愈。值得注意的是，siRNA需要合适的载体来实现静脉给药，目前有一些临床试验通过特定途径将HBV特异性siRNA传递到被感染肝细胞。特异性siRNA与GalNAc偶联形成GalNAc-siRNA能够通过皮下用药进入体内，与肝细胞上高度表达的脱唾液酸糖蛋白受体相互作用。EASL ILC于2018年首次报道了这种新型siRNA：AB-729在Ⅰa/b期临床试验中能够以4个HBV的开放阅读框(ORFs)作为靶标，有效地拮抗A～H型HBV，在高浓度下无细胞毒性；且前期实验表明，每月给药能够显著降低动物模型HBsAg、HBeAg和HBV-DNA水平[18]。ARB-1467是一类包含了3种siRNA的脂质纳米颗粒(LNP)，单次或多次给药后能够靶向3个不同的位点抑制转录后HBV抗原的合成，如HBsAg[19]。另一种药物JNJ-3989(也称ARO-HBV)能够沉默HBV-RNA和宿主整合的HBV-DNA。实验研究显示，此药能够迅速降低所有可测量病毒产物的水平，包括HBeAg阳性和阴性病人的HBsAg水平[20]。此外，一项ⅡA期多中心随机临床试验结果显示，GSK3389404(一种反义多聚核苷酸)给药3个月可以迅速降低HBeAg阳性和阴性病人的HBsAg水平[21]。

2.4 核心蛋白抑制剂

核心颗粒中的pgRNA是逆转录合成负链DNA链的模板，由于pgRNA能够被核糖核酸酶(RNase)H裂解，所以RNase H抑制剂能够抑制这个过程的发生并阻止正链DNA的合成。基于以上原理，RNase H抑制剂类药物也是一种潜在的HBV治疗方向，这类药物如α-hydroxytropolones、N-hydroxyisoquinolinediones和N-hydroxylpyridinediones的临床研究正在进行中[22-23]。

HBV核心蛋白在整个病毒复制周期内能够脱膜释放rcDNA、合成核衣壳并包裹pgRNA、在病毒最终形成阶段与HBsAg结合。该蛋白能够结合细胞启动子和cccDNA，改变核间隙并调节基因表达，因此核心蛋白抑制剂是一种潜在的研究方向。目前有两类核心蛋白变构调节剂(CpAMs)：Ⅰ型(杂芳基二氢嘧啶(HAP))和Ⅱ型(苯基丙烯酰胺、氨磺酰基苯甲酰胺和其他型)。HAP衍生物能够诱导核心蛋白二聚体组成异常的非衣壳聚合物从而降解核蛋白[24]。甲磺酸莫非赛定(GLS4)能够抑制病毒在肝细胞系上清液中的堆积，降低肝肿瘤小鼠体内HBV-DNA水平[25]。一种口服Ⅰ型CpAMs RO7049389能够诱导异常HBV核蛋白聚集体的形成，阻止HBV的合成和复制。基于RO7049389药物的安全性、耐受性、药代动力学以及抗HBV活性的Ⅰ期临床试验仍在进行中，不过现有数据表明，给药4周后，慢性、无肝硬化乙肝病人的HBV-DNA、HBV-RNA水平显著下降，但是HBsAg水平没有显著变化[26]。另外，对比现有CHB疗法，HAP_R01具有更高的血清HBeAg转阴率，也是潜在的抗HBV药物之一[27]。Ⅱ型CpAMs能够加速衣壳的组装，同时阻止pgRNA包裹，从而组装空衣壳[28]。EDP514能够降低小鼠HBV-DNA、HBV-RNA、HBsAg和HBeAg的水平，并且能够与其他核心蛋白抑制剂协同抗病毒[29]。另外，AB-423、ABI-H0731、JNJ-56136379和JNJ-6379也正处于研究阶段[30-31]。

2.5 HBsAg抑制剂

乙肝表面抗体(HbsAb)对HBV感染具有免疫抑制作用，包括获得性免疫和天然免疫。临床研究发现，血清中HBsAg的消除可以增强机体对HBV的免疫作用，并且放大Peg-IFN-a的效果[32]。REP-2055、REP-2139和REP-2165可以抑制肝细胞中HBsAg的释放[33]。HBV/HDV合并感染病人持续15周、每周1次接受REP-2139-Ca静脉注射，接下来15周每周1次联合使用REP-2139/Peg-IFN-a静脉注射，然后接受单药Peg-IFN-a治疗33周，试验终止后，42%的病人体内HBsAg被清除[34]。然而，多次使用REP-2139-Ca能够加重肝脏负担，而有试验显示REP-2165能使REP-2139在保持抗病毒活性同时减少对肝脏的毒副作用。

成年人从急性HBV感染中的自主恢复依赖于广泛的多种特异性免疫反应。虽然先天免疫应答自然清除HBV感染的机制尚不明确，但最近的研究表明，NK细胞参与早期HBsAg的清除，其他细胞可能参与免疫调节[35]。在症状出现前，病毒滴度下降可能与病毒复制过程中NK和NKT细胞分泌IFN-α介导的非细胞溶解抑制有关。实验表明，自然条件下针对病毒蛋白(例如HBcAg)的HBV的特异性细胞毒性T细胞(CTL)应答反应强烈并具有多克隆性质，在清除被感染的肝细胞过程中十分重要[36]。

不同于急性HBV感染，CHB感染的原因与机体对HBV的特异性免疫反应有关。感染初期由于NK细胞和浆质树突细胞(pDC)功能异常导致分泌IFN-a不足而使得先天免疫反应过慢。下游的抗原呈递细胞(例如DCs)成熟过程被HBsAg或者HBeAg破坏，从而诱导免疫耐受。另外，在免疫病理学方面，促炎细胞因子的存在导致单核/巨噬细胞、NK、NKT和T细胞浸润肝组织，引起慢性肝炎[37]。然而，CTL的局限性和特异性使其不足以清除所有感染肝细胞内的病毒。因此，任何新疗法都应该旨在消除感染肝细胞的病毒、避免健康肝细胞被感染、建立长期病毒控制和消除cccDNA储存库。

Toll Like Receptors(TLRs)是抵御入侵微生物的第一道防线。它们感受病原体相关分子(PAMPs)，通过信息传导产生细胞因子。TLR-7、8激动剂参与内源性IFN的产生、IFN刺激基因(ISGs)的诱导以及其他信号通路(如JAK/STAT)的激活。TLR-7激动剂GS-9620在人类肝细胞系HepaRG和感染HBV原代细胞中，能够通过诱导Ⅰ型IFN持久抑制复制，但是不能降低cccDNA水平[38]。然而此药应用于NAs治疗的HBV病人时，对HBsAg水平没有显著影响[29]。联用TLR-7激动剂(RO7020531)和一类衣壳装配调节剂(RO749389)能够显著降低AAV-HBV小鼠的HBV-DNA和HBsAg水平[40]。在人体内，单次和多次递增剂量的RO7020531能够激发IFN-a诱导的细胞因子和ISGs产生[41]。维甲酸诱导基因1(RIG-1)能够激活ISGs产生IFN-a和其他抗病毒细胞因子。未曾接受治疗的CHB肝硬化病人接受RIG-1/NOD-2激动剂Inarigivir(SB 9200)12周再改用富马酸替诺福韦治疗12周后，HBV-DNA、HBV-RNA和HBsAg水平均降低[42]。另外，干扰素基因激动剂、PD-1抑制剂等也处于临床研究阶段。

获得性免疫主要是通过疫苗调节来实现。最近研发的ABX-203(HeberNasvac)是一种含有HBsAg和HBcAg的鼻腔注射疫苗。Ⅲ期临床研究表明，疫苗和Peg-IFN-a对于病人HBV-DNA的抑制率相似(59.0% vs 62.5%)，但是疫苗展示出更高的血清HBeAg转阴率[43]。INO-1800是一种能够编码HBsAg和HBcAg序列的疫苗，在动物实验中展示出强大而广泛的细胞介导的免疫力[44]。然而该疫苗需要通过电穿孔给药，这种给药方法较难实施而且可能产生副作用。GS-4774是一种重组、热灭活的酵母型疫苗，能够编码HBsAg、HBcAg和X蛋白，虽然临床试验中此疫苗相较口服抗病毒药物并没有实质性的突破，但是它能刺激IFN-a、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素2(IL-2)的产生，并且能刺激CD8+T细胞的免疫抗炎活性[45]。

3 乙肝的中医治疗进展

中医药在乙肝治疗中具有十分重要的地位。近年来中医药在单方和复方制剂抗HBV的研究方面取得了一定的进展。中医通常将乙肝归为“肝温”“肝毒”“胁痛”“黄疸”等范畴，一般认为其中医的病因病机为正气不足、湿热疫毒侵袭，导致湿热郁结、肝郁脾虚、肝肾阴虚等[3,46-52]。治疗上采用清热利湿、舒肝健脾、滋阴解毒等治则。加减逍遥散是一个经典的中医方剂，常用来治疗肝郁气滞型的CHB病人。有研究表明，运用该方剂治疗2月能够显著提升该型CHB病人的肝功能[53]；使用该方剂联合恩替卡韦治疗CHB半年后，病人的症状包括腹胀、肝郁等得到明显改善，有效率高达83%[54]。中药复方肝复康能够增强T淋巴细胞的免疫清除功能，阻断HBV复制，显著降低HBsAg水平[55]。扶正解毒汤能够抑制病毒复制、减轻肝损伤，服用半年后CHB病人的临床症状明显改善[56]。五虎汤配伍白术、大枣、莱菔子、茯苓等健脾益气类中药可以明显改善CHB病人的胁痛、心悸及腹胀等症状[57]。小柴胡汤加减则能够改善肝功能，提高HBV-DNA的转阴率[58]。这些研究表明，中药方剂有可能成为未来乙肝治疗的药物。

中药单味药及单体化合物治疗乙肝的研究也受到广泛关注。有研究结果表明，叶下珠制剂具有抗HBV活性、抑制HBsAg和HBeAg产生的作用，同时还能够防止和延缓肝纤维化和肝硬化[59]。苦参根中的生物碱苦参素可以阻止HBV的复制，显著提高人体免疫力[60]。黄芪能够激活肝脏内质网的应激作用，黄芪中的黄芪多糖能刺激细胞因子和内源性IFN的产生，清除HBV，保护肝功能，防止或延缓肝癌的发生[61]。网络药理学研究表明，黄连及其活性成分(如穆坪马兜铃酸酰胺、盐酸巴马汀、槲皮素、小檗碱等)能够通过多成分-多靶点协同与潜在靶标蛋白分子MAPK1、MAPK3、MMP3以及CASP3等对接，发挥保肝抗炎从而治疗乙肝的作用[62]。

最近，有研究显示，在CHB的治疗上，针灸、穴位注射、针灸配合中药或西药治疗，能够显著提高HBeAg和HBV-DNA的转阴率[63-65]。针灸治疗CHB可能是一个具有前景的课题。

4 CHB的联合/序贯抗病毒治疗

国际上CHB的治愈分为完全治愈和临床治愈。完全治愈也称病毒学治愈，是指血清中检测不出HbsAg，血清整合HBV-DNA和肝内cccDNA完全清除。由于目前尚无针对cccDNA的特异性靶向治疗药物，故完全治愈很难达到。CHB防治指南认为最理想的治愈为临床治愈，临床治愈又称功能性治愈，是指血清中HBsAg和HBV-DNA均检测不出，HBeAg转阴，肝脏慢性炎症缓解，肝功能指标ALT正常，肝组织病理学改善。随着治疗方案的不断优化，抗病毒药物和免疫调节剂通过联合/序贯治疗，强效抑制病毒，恢复机体免疫应答，使临床治愈的实现成为可能。有Meta分析结果显示，在病毒学和血清学反应中IFN与NAs联合治疗CHB的效果优于IFN的单一疗法[66]。LIU等[67]通过检索Web of Science和Embase databases数据库，综合性分析发表的相关数据发现，IFN联合NAs治疗或者NAs治疗后序贯IFN治疗与NAs单一治疗相比较能够明显提高HBsAg的清除率。CHEN等[68]的临床研究结果显示，HBeAg阴性CHB病人在接受NAs治疗24周后增加Peg-IFNα-2b联合治疗，治疗48周后，其HBsAg清除率和血清转换率均显著高于NAs单独治疗组。但是，在临床上选择IFN与NAs联合使用或序贯使用或者单独使用时不能一概而论，而要根据防治指南及病人自身的实际情况综合考虑。

5 结语

乙肝是多发性顽疾。HBV通过不断更新的cccDNA储存库而持续存在于肝细胞核中，半衰期较长。免疫应答受损和无效严重阻碍了感染HBV肝细胞的清除。乙肝并发症的高发在世界上引起广泛的关注，虽然抗病毒药物能够高效抑制HBV复制，但cccDNA清除、停药反应以及耐受性差等仍是问题所在。因此，现有的乙肝治疗药物和方法仍有局限性，单一靶点治疗乙肝毒性大、治愈率低。在过去的几年中，关于病毒生命周期和病毒作用机制方面的研究取得了很大的进展，为新药的开发指明了新的方向，包括HBV附着抑制剂、RNA干扰、核仁核心抑制剂、HBsAg抑制剂和免疫疗法等。中医药治疗乙肝也在临床、实验研究中展示出较好的疗效与较低的副作用，因此临床上中西医结合、联合/序贯治疗乙肝可能会为当代医学的发展提供新的方向。