白血病抑制因子在心血管疾病中的研究进展

陈施鉴，陈者旭，张邢炜

(杭州师范大学附属医院 心血管内科，浙江 杭州 310015)

炎症因子激活在多种心血管疾病的病理生理发展过程中有着明确的意义，循环炎症因子可以预测心血管病患者病情的预后转归，针对炎症因子的治疗也取得了一定成效[1]。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)作为白介素6(interleukin-6，IL-6)家族中最具有多效性的细胞因子，由180个氨基酸组成，可在体内外环境中激活LIFR-GP130受体，通过JAK/STAT、PI3K等信号通路参与到缺血再灌注损伤、干细胞增殖、肿瘤进展、骨骼重塑、神经发育中[2]。LIF参与心血管疾病的发生发展，使对LIF的干预成为治疗心血管疾病的新的可能。本文对LIF参与信号通路以及在各心血管病中的作用机制的研究进展作综述如下。

1 LIF受体及其信号通路

1.1 LIF受体 LIF于1987年被 D P Gearing等人成功克隆，因其具有广泛的分布范围及多向性的功能信号受到科学家们的深入研究。IL-6家族受体复合物包括共享信号转导受体β亚单位、gp130以及配体结合非信号受体α亚单位或类似gp130的信号受体β亚单位[3-5]，使用共同的gp130受体亚单位有助于调节由IL-6家族细胞因子控制的广泛且重叠的活动。作为IL-6家族的一员，LIF受体由gp130和LIFR两部分组成，被抑瘤素M、心肌营养素1、睫状神经营养生长因子、心肌营养素样生长因子所共享[6]。在不同的细胞类型中，LIF可以表现出相反的功能，这可能归因于其中一条由LIF激活的下游信号通路在该细胞中占主导地位或是在同一信号通路中LIF对不同转录因子(STAT1、STAT3)的激活程度不同[5]。

1.2 LIF介导的信号通路 目前的研究已发现LIF具有激活下游包括PI3K/Akt、JAK/STAT、MAPK及Hippo等信号通路的能力，其中在心血管领域对LIF激活的PI3K/Akt、JAK/STAT的研究已初步建立体系。LIF的下游信号分化主要归因于gp130 和LIFR细胞内区域存在两个模体(YXXQ和YXXV)，这两个模体允许不同信号分子的招募和激活，在结合后可被JAK酪氨酸激酶磷酸化[6]，一旦完成磷酸化，便可诱导下游的信号瀑布的发生，从而参与到抗凋亡、抗氧化、血管再生、心肌肥厚及心脏保护的过程中。

2 LIF与心血管病的关系

2.1 心肌保护 在心肌细胞损伤的急性期，常伴有大量炎症因子的激活，多种信号通路共同参与。现有的研究表明，由LIF激活的MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt通路与心肌细胞急性缺血/再灌注(I/R)损伤的短期保护有关，其机制可能为这两条通路能通过减少线粒体通透性转换孔的开放从而抑制氧化应激造成的细胞损伤[7]。Maulik等[8]在研究蒽环类药物对成年大鼠心肌损伤机制时发现，缺血预处理能通过PI3K途径保护受阿霉素损伤的心肌，这一过程独立于MAPK/ERK1/2的作用，且与氧化应激和线粒体通透性转换孔开放减少无关，这意味着PI3K/Akt途径可能存在尚未揭示的心肌保护机制。同样地，LIF对JAK-STAT通路的调控也参与了对应激心脏的保护，以延缓心肌重构及纤维化的发生[9-10]。氧化应激被认为是参与心脏缺血再灌注损伤的重要理论基础，而谷胱甘肽作为一种还原剂会在该病理过程中被耗竭。Kurdi等[11]采用左旋丁硫氨酸-磺酰亚胺(BSO)预处理心肌细胞以抑制谷胱甘肽的合成，在24 h后给予细胞外源性IL-6及LIF，结果发现：谷胱甘肽的耗竭抑制了LIF诱导的细胞内JAK1-STAT3的激活，而STAT1激活不受影响，在心肌细胞中，STAT3主要参与心肌保护，而STAT1则与细胞凋亡相关。这一实验模拟了在心肌急性损伤或急性心力衰竭过程中，由于氧化应激反应的发生，细胞内还原产物的锐减，导致LIF介导的JAK1-STAT3信号通路对心肌保护作用减弱，而STAT1与STAT3比例的失调进一步加重了心肌细胞的损伤。这也提示维持正常的细胞内氧化还原环境是STAT3发挥其心肌保护作用的基础。Jia等[12]通过建立心梗小鼠模型，观察到间歇运动能明显改善心梗后小鼠的骨骼肌萎缩及心功能恶化。心肌梗死的发生下调了大鼠骨骼肌中LIF及LIFR的表达，且减少了腓肠肌中LIF介导的STAT3磷酸化，从而抑制了LIF/STAT3途径对心梗后骨骼肌增殖与凋亡的调控，这一过程可被间歇运动或加入外源性LIF所改善，其机制被推测与LIF能通过旁分泌的形式促进骨骼肌中卫星细胞的增殖有关。上述研究表明，LIF能通过多种途径对急性损伤期的心肌细胞起到保护作用。

2.2 心脏再生 干细胞治疗作为21世纪最为热点的医学研究之一，已有大量的医学团队为之进行了深入探索，其中包括心脏领域曾红极一时的内源性成体心肌干细胞及干细胞移植治疗，然而后续的实验研究逐步推翻了该理论的真实性，使得干细胞治疗引起了学界极大的争议。早在LIF被发现的初期，就有研究表明LIF参与了多功能胚胎干细胞的形成，并能维持其多功能的状态，在促进原始生殖细胞的增殖和骨髓重塑中起到重要作用。胚胎干细胞有分化为心肌细胞及血管内皮细胞的能力，如今的研究开始放在LIF对于胚胎干细胞的支持作用上，为心脏再生的治疗开辟新方向。Blüguermann等[13]通过分离正在经历向心肌细胞分化的人多功能胚胎干细胞，观察到LIF在不同发育阶段的人类心脏胚胎干细胞中广泛表达，且在一个精准时间窗内加入外源性LIF可显著提高体外培养心脏胚胎干细胞的存活能力，其机制被证实为LIF/STAT3能通过降低促凋亡因子Bax在细胞内的表达量从而调节细胞的凋亡易感性，起到提高其存活率的作用。在此之前，Iwakura等[14]的研究就发现了LIF激活STAT3可诱导心脏Sca-1+细胞的内皮分化，并通过DNA阵列实验发现该过程与Pim-1基因激活相关，Sca-1+细胞曾被认为具有分化成为内源性心肌细胞的能力，然而后续的大型研究证明Sca-1+细胞不太可能直接分化为心肌细胞，其功能可能是标记血管内皮，被Sca-1标记的心肌细胞在对抗心肌损伤及衰老时有更强的增殖能力[15]，而这一标记过程可能被LIF/STAT3途径激活。同样地，Pozzi等[16]在对Hesx1基因遗传缺失的小鼠研究中发现，Hesx1基因的遗传缺失能通过降低多能性因子的表达和LIF/STAT3信号的活性来损害自我更新并促进向外胚层的分化，致使小鼠胚胎干细胞发育停滞，从侧面反映了LIF/STAT3在干细胞多能性维持及促进包括心脏在内的器官发育中具有重要作用。Kanda等[17]通过对小鼠心室肌细胞注射他莫昔芬诱导其发生心肌梗死，采用X-gal法对99.9%以上的双转基因小鼠心肌细胞进行染色，并对实验组注射LIF后发现，相比于对照组，实验组心梗后小鼠具有更大面积的X-gal阴性心肌细胞，LIF明显改善了实验组小鼠心肌功能；同时他们发现在心脏侧群细胞中，LIF可激活JAK-STAT、MEK/ERK及PI3K/Akt信号通路以刺激心肌细胞的再生，这可能是血中LIF水平的升高加速了心脏侧群细胞的细胞周期，促进心脏干细胞增殖，并缩小了心肌梗死的面积。

虽然目前的实验结论已基本否定成体内源性干细胞直接分化为心肌细胞的可能性，但干细胞治疗作为心脏再生最有希望的研究方向，始终值得科学家们的不断探索。如今学界早已不拘泥于对内源性心肌干细胞研究，而是另辟蹊径，开始着眼于诱导胚胎干细胞、编程后iPS细胞分化为心肌细胞[18]及寻找促进成体心肌细胞增殖的方法[19]。总之，LIF在维持胚胎干细胞多功能性、提高其存活率上的作用是肯定的，在未来作为心肌损伤及心脏再生的治疗靶点仍具有巨大的潜力，亟需更为确凿的结论为之佐证。

2.3 心力衰竭 心力衰竭作为几乎所有心脏疾病的中晚期表现，包含了不同的病理生理机制，如神经内分泌调节、心室重塑以及炎症因子的爆发。近年来，血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂的投入临床，在传统“金三角”治疗方案的基础上，进一步使心衰患者的预后得到改善，但仍然没有解决后期炎症因子的过度激活。现有的研究表明，IL-6可作为预测心衰患者预后的独立因素，其相关靶向药物也已投入临床研究。作为LI-6家族的一员，早期对LIF的研究大多数集中在LIF参与了急性心肌损伤的过程，鲜有证据能够揭示LIF与慢性心脏疾病的发生发展的关系。随着研究逐渐发现了LIF在自发性高血压小鼠的血浆及衰竭心室中存在大量表达，并与心衰的严重程度呈现显著相关性[20]。目前有两种理论支持LIF参与了心衰的发展过程：LIF/JAK/STAT3信号通路以及通过胆碱能转分化影响心肌机械电活动。主流的观点认为这两种机制均改善了心功能并延缓了心室重构的发展。然而，亦有研究提出LIF大量表达背后的影响并非是完全正向性的。

与LIF保护心肌细胞免受急性缺血再灌注损伤的机制相似，在慢性损伤应激中，LIF很可能是通过激活下游的JAK/STAT3信号通路起到对心肌的保护作用，早在2004年Hilfiker-Kleiner等就发现心肌细胞特异性敲除STAT3会诱发年龄依赖性心力衰竭[21]。如今已有越来越多的证据揭示了LIF/JAK/STAT3信号通路在心肌功能保护及延缓心肌重构中发挥了重要的作用。Zgheib等[22]通过给予心衰小鼠外源性LIF治疗的研究发现，经LIF处理的小鼠射血分数和缩短分数分别增加了21%和32%，在组织学上没有观察到心脏肥大，心脏全能性长度比没有变化，也没有观察到心脏纤维化。并在左心室观察到STAT3被显著激活，印证了LIF通路在预防心衰中发挥了关键作用。此外，Mao等[23]采用多柔比星注射制造扩张性心肌病大鼠模型，通过人骨髓间充质干细胞(hUCMSCs)注射观察到：其能显著提高左心室射血分数(LVEF)和左心室分数缩短(LVFS)并显著改善扩张型心肌病大鼠的心衰表现，且升高外周血中的HGF、LIF、GCSF和VEGF因子的表达量，其中只有LIF的升高与hUCMSCs的使用剂量呈显著正相关性，间接揭示了与hUCMSCs可能通过LIF信号途径对心肌细胞产生正向影响。

另一种被证明的途径是LIF通过使心脏交感神经胆碱能转分化，平衡了心室中去甲肾上腺素与乙酰胆碱的分泌量，使原本被交感神经激活代偿性升高的心率下降从而延缓了心室重构。Kanazawa等[24]通过建立充血性心衰小鼠模型发现，心脏特异性过表达LIF小鼠的心脏交感神经呈现高度胆碱能转化，且交感神经胆碱能转分化程度与LIF左心室的表达量呈正相关性，同时在体外培养的大鼠心衰心肌细胞分泌LIF所致的胆碱能转分化亦可被LIF靶向的siRNAs所逆转，并且观察到交感神经特异性靶向编码LIF和CT-1受体gp130亚单位的基因可防止心力衰竭诱导的胆碱能转分化，这进一步证明了LIF通过LIFR-gp130参与了心衰胆碱能转化的发生。然而，也有研究认为胆碱能分化可能会加速失代偿心力衰竭的发展。Wang等[25]亦发现，心肌梗死后的胆碱能转分化延长了远端和边缘区心肌细胞的动作电位时程，降低了动作电位的异质性，从而具有抗心律失常作用，而这种在心肌梗死中发生的胆碱能转分化现象被证明是通过gp130诱导的[26]。然而在Wang等[27]通过对使用桂枝汤抑制心衰大鼠心脏交感神经转分化的研究中发现，桂枝汤能通过升高NGF并降低LIF在心脏中的表达延缓失代偿性心力衰竭的进展。Fernandez等[28]的研究亦有力地支持了这一推测，他们认为胆碱能刺激的增加会减弱心脏收缩性并抑制心电传导，使本已失代偿的心功能进一步恶化。心肌细胞胆碱能受体的上调在衰竭的心脏中是一把双刃剑，从长远来看，心脏交感神经(SNS)的过度激活会造成包括心脏重塑在内的一系列心肌毒性作用，而SNS向胆碱能神经(PNS)转化的过程很可能是心脏为了适应这种高负荷环境从而形成一种内源性的保护机制；然而胆碱能神经过度转化，以及LIF的失衡亦会造成包括P-R间期延长、心肌病理性损伤等诸多问题[27]。总之，LIF在心力衰竭中作用的利弊仍需更多研究加以证实。

2.4 心肌肥厚 促进心肌肥厚的因素往往不是单一的，虽然目前关于心肌肥厚的原因尚不明确，但是炎症因子被证明在心肌肥厚发生和发展过程中均起到关键作用。IL-6家族的gp130依赖性细胞因子包括IL-6、LIF和心肌营养素1等均与心肌细胞的肥大密切相关。gp130/LIFR激活相关的三种主要信号通路已在体内外都被证明能诱导心肌肥厚。Fahmi等[29]通过观察大鼠心肌细胞大小和肌丝组织等形态学特征的变化、心肌细胞特异性标记物的染色和基因表达发现，IL-6、LIF具有诱导离体培养的新生大鼠心室心肌细胞肥大的能力，并且证明了与ERK1/2、PI3K/Akt及JAK/STAT信号通路的激活相关，IL-6与LIF诱导心肌肥大的方式相似，均能让肌丝从与细胞长轴对其的线性模式重组成为伴随应力纤维增加的放射状模式。但相较于IL-6，用LIF处理的细胞中α-肌动蛋白和细胞外基质标记层粘连蛋白的染色程度较低，暗示了两者诱导心肌肥大亦存在表型差异。Li等[30]对内皮素诱导心肌细胞肥大模型的大鼠研究后发现，与对照组相比，给予肿瘤坏死因子-α抑制剂依那西普的大鼠LIF及其他炎症因子的表达量明显下降，同时明显下降的还有包括心钠素、基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-13在内的心肌肥厚相关标志基因mRNA的表达水平，提示依那西普能通过抑制炎症因子激活和调节心肌肥厚相关基因表达起到延缓心肌肥厚的作用。研究中亦观察到依那西普显著增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达并降低了促凋亡蛋白Bax的表达，暗示凋亡蛋白表达失衡参与了心肌肥厚的发展。而先前的研究已明确LIF能通过PI3K/Akt途径参与调控Bax与Bcl-2的表达，提示LIF可能通过细胞凋亡诱导了心肌肥厚的发生[31-32]。细胞因子信号抑制物(suppressor of cytokine signaling,SOCS)能够通过抑制包括LIF在内的炎症因子的过度激活及其诱导的Ca2+内流以延缓心肌细胞肥厚性病理改变，其中SOCS1和SOCS3均能与gp130受体结合从而抑制JAK/STAT通路的激活。在Rocha-Resende等[33]对野生型和SOCS2-KO小鼠心肌细胞的实验中观察到，与对照组相比，SOCS2-KO组中LIF无法成功诱导瞬时内向钙离子流。已知LIF激活的MAPK/ERK通路能有效升高细胞内Ca2+，而Ca2+内流的缺失提示LIF信号通路在SOCS2-/-中被完全抑制，然而这与实验结果中观察到ERK、STAT3的升高不符。其机制可能与在SOCS2缺失的情况下LIF和刺激Ca2+内流的下游信号通路脱偶联以及SOCS3被代偿性过度激活相关。总之，LIF参与诱导了心肌肥厚的形成过程，抑制LIF的表达可一定程度延缓心肌肥厚。

3 小结与展望

作为IL-6家族中的一员，近年来LIF在心血管领域的作用已得到了一定的拓展。LIF对胚胎干细胞的存活起支持作用，并能有效地保护并修复受损的心肌细胞，这使得未来对LIF在干细胞治疗中的作用研究具有极大的潜力。目前，主流的研究聚焦于LIF对心梗缺血灌注后损伤、心力衰竭、心肌肥厚的促炎作用上，然而作为一个独立的炎症因子，其起到的作用仅是冰山一角，且由于当前实验LIF表现出的两面性特征以及缺乏大型试验的对比，使得其对慢性心脏病变的影响仍有待商榷。总之，对于LIF在心脏方面的研究仍需不断深入，完善其信号通路网络，以明确具体的临床作用，成为新的治疗靶点。