阿尔茨海默病体外诊断纳米技术*

宋诗洁 朱 凌 王 琛** 杨延莲**

（1）国家纳米科学中心，北京 100190；2）中国科学院大学中丹学院，北京101400）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种最常见的神经退行性疾病。最新数据显示，目前全球大约有包括AD 患者在内的5 000 万痴呆患者，预计到2050 年，这一数字将达到1.52 亿［1］。在20 世纪初，德国神经学家Alois Alzheimer 首次发现一种疾病，其主要特征是认知的进行性和不可逆转的衰退［2］，这种疾病后来被命名为AD。该疾病的主要病理特征表现为：a.β 淀粉样蛋白（amyloid beta peptide，Aβ）过度沉积形成老年斑［3］；b.过度磷酸化的tau 蛋白聚集形成神经原纤维缠结［4］。Aβ和tau蛋白的积累会导致大脑中与记忆相关的突触和神经元的大规模损伤，进而造成严重的记忆丧失和认知丧失。

AD 从发生到出现临床症状耗时长达15～25年［1］。美国国立衰老研究所（National Institute of Aging，NIA）和阿尔茨海默病协会（Alzheimer’s Association，AA）提出的诊断标准认为，AD的发展是一个连续进展的过程［5］。该诊断标准将AD的进展分为3 个阶段。a.临床前期（preclinical）：蛋白质错误折叠、聚集并开始在大脑中的积累，神经元的活性有所降低但是并没有出现临床症状；b.轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）：与记忆形成相关的海马体功能受损并且出现脑萎缩和认知损伤等症状；c.痴呆（dementia）：记忆力严重损伤并伴随全身性损伤，患者日常生活不能自理［6］。

目前，AD 的临床诊断主要通过认知测试、影像学检查以及脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）分析来实现［7］。认知测试往往会受到主观因素的影响，因而诊断准确率不高。相比之下，影像学检查是一种更直观的检查手段。AD诊断常用的医学影像技术有用于海马体成像的磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）以及评估Aβ在大脑皮层沉积的正电子发射型计算机断层显像（positron emission computed tomography，PET）技术［8‑9］。然而，这些影像学诊断方法价格昂贵，检测成本偏高。CSF分析则具有侵入性，给患者带来极大的痛苦。因此迫切地需要一种具有非侵入性、操作简单的低成本诊断方法。

目前发展的以血液为基础的体外诊断技术，在AD 早期诊断方面突显优势。近年来，质谱（mass spectrometry，MS）分析技术已经应用于AD 生物标志物的筛选［10］和检测［11］，成为以体液为基础的AD早期诊断的有用工具［12］。为了获得小型化、便携式的AD体外诊断工具，研究者们积极发展基于纳米技术的AD生物标志物的检测平台。纳米材料和纳米技术的高表面活性、独特的光电特性、生物相容性好、易于表面修饰、小型化、集成化等特点，使得研发具有更高灵敏度、选择性和稳定性的AD体外诊断技术成为可能。本文分别从生物标志物的富集、信号的转导与增强、灵敏度的提高以及临床价值等方面介绍纳米技术在伏安/阻抗检测、电导检测、表面等离激元共振检测、表面增强拉曼散射检测以及电化学发光检测等AD传感检测平台中的应用（图1）。

Fig.1 Schematic illustration of sensing platform for detection of AD biomarkers图1 用于检测AD生物标记物的传感平台示意图

1 生物标志物

蛋白质错误折叠、聚集以及积累是AD等神经退行性病的主要病理特征［13‑15］。尽管这些蛋白质的序列、结构、大小以及功能各异，但在患者的大脑中都经历了由单体聚集形成小的寡聚体，再到大的原纤维、纤维的过程［16］（图2）。起初，研究者们认为在大脑中大量沉积的蛋白质具有神经毒性，但有越来越多的证据表明，由蛋白质错误折叠产生的可溶性寡聚体才是造成神经毒性的关键因素［17‑19］。错误折叠的聚集体小到二聚体，大到由数百个单体组成的原纤维［20‑21］，这些异常变化的蛋白质聚集体逐渐被作为生物标志物应用于AD的早期诊断。

Fig.2 Amyloidogenic proteins aggregate via multiple pathways into different assembly structures［16］图2 淀粉样蛋白通过多种途径聚集成不同的组装结构［16］

Aβ 是一类最重要的早期诊断生物标志物。在正常人体内，淀粉样蛋白前体（amyloid precursor protein，APP）被α 和γ 蛋白酶切割，产生不具有神经毒性的多肽片段。在AD 患者体内，APP 在β和γ 蛋白酶的作用下分解成具有39～43 个氨基酸的多肽，其中Aβ42和Aβ40这两个片段与AD疾病的发生发展密切相关［2，22］。大量Aβ聚集形成的寡聚体会产生神经毒性，导致大脑内的神经元和突触受损，从而影响患者的记忆和认知［23］。最近，有观点认为在众多Aβ聚集体中，Aβ二聚体是最主要的毒性蛋白形式［24］，这可能开启AD 研究的新阶段。近年来，纳米技术的发展使得AD 患者CSF 中Aβ的微量变化能够被获取［25］，因此逐渐发展了众多基于CSF 中Aβ 检测的早期诊断技术。CSF 分析成本高，取样困难，给患者带来极大的痛苦。2018年，Nakamura等［26］提出血浆Aβ与CSF中Aβ浓度存在相关性，并且检测结果与PET 的诊断结果吻合度达到90%，这意味着血液检测有望成为替代CSF分析的新方法。随后，逐渐发展了以血液标志物为基础的检测技术。

tau 蛋白是一种结合在微管上的蛋白质，其正常功能是维持微管的稳定性，降低微管蛋白分子的解离。从微管上脱落的tau 蛋白在脑部聚集，形成的神经纤维缠结被认为是AD 病理特征之一［27］。有研究者还发现，AD 患者脑部tau 蛋白会出现过度磷酸化的现象［28‑29］，过度磷酸化会导致tau 正常生物活性的丧失，引起微管解体和轴突运输功能的破坏［30］。另外，Aβ 能够加速tau 蛋白的过度磷酸化［31］以及配对螺旋样纤维（paired helical fibers，PHF）［32］的形成，并且能够促进tau 蛋白的聚集和扩散［33‑34］。

tau 蛋白中有85 个潜在的磷酸化位点，在AD大脑内检测出了约45个特异磷酸化位点［35］，其中CSF 中p‑tau181（phosphorylated tau181）［36］以及p‑tau217（phosphorylated tau217）［37］被认为与AD病理相关。近期，研究者比较了p‑tau217 与p‑tau181 作为AD 生物标志物的有效性，PET 结果显示p‑tau217 能够更准确地区分AD 和其他神经退行性疾病［38］。越来越多的结果证明［39‑41］，血浆中磷酸化的tau，尤其是p‑tau217，与AD疾病进展密切相关。

目前已报道了许多新型的AD早期检测生物标志物［42］，除了有构成神经元细胞骨架的神经丝蛋白L（neurofilament light，NFL）［43］、与tau mRNA代谢相关的交互反应DNA 结合蛋白43（transactive response DNA binding protein 43，TDP‑43）［44］、影响Aβ 生成的去整合素金属蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10）［45］，还有与炎症和神经元损伤相关的髓系细胞触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）［46］、人几丁质酶3 样蛋白‑1（chitinase 3‑like 1 protein CHI3L1）［47］以及视锥蛋白样蛋白1（visinin‑like protein 1，VLP‑1）［48］等。国际工作组（International Working Group，IWG）仅将Aβ和tau蛋白纳入诊断标准之中，目前关于AD 早期诊断的研究也主要集中于Aβ、tau 蛋白以及与之相关的蛋白质。最新的AD诊断标准［1］认为，只有临床表型阳性以及Aβ和tau蛋白生物标志物同时表现为阳性才可以确诊为AD，因此未来多靶点检测的方法将成为AD 早期检测的重要手段。由于生物标志物阳性患者的异质性特点，目前依然无法给出一个确定的阳性判断值，这进一步限制了生物标志物检测方法在临床上的应用。

2 纳米技术在AD体外诊断中的应用

以纳米技术为基础的AD体外诊断技术是目前较为先进的检测技术。纳米技术不仅能够实现低浓度生物标志物的富集，还能够将生物反应转化为光电信号并且将这些信号进一步放大，因此利用纳米材料或者纳米技术构建的纳米生物传感器平台能够在常规检测技术无法检测的浓度范围内定量分析CSF和血液中AD相关的生物标志物。

尽早地识别AD有利于后续的治疗，因此早期诊断成为AD研究领域一个备受关注的问题。目前AD的早期诊断迫切需要灵敏、精准、便捷、经济的检测技术，AD 的纳米体外诊断技术在早期诊断、预后判断以及疗效评估等方面展现了极大临床应用潜力。

2.1 生物标志物的富集

通常情况下，目标蛋白在体液中的含量极低。例如，在CSF和血液中，Aβ和tau蛋白的浓度低至皮摩尔级别［49］。另外，复杂的体液环境为目标蛋白的检测增加了难度。因此，许多检测技术需要在检测目标蛋白之前对其进行预富集和分离。

免疫捕获是一种依靠抗原‑抗体相互作用实现蛋白质、多肽等生物分子捕获和浓缩的富集技术［50］。免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）是目前最常用的免疫捕获新型生物纳米材料。IMB实质上是一种表面覆盖高分子或者化学小分子的磁性纳米颗粒，表面修饰的氨基、羧基、巯基等能够与抗体偶联，磁性纳米颗粒的超顺磁性使其能够在外加磁场的作用下定向移动。目前，免疫磁珠已经可以用于细胞［51］、细胞外囊泡［52］、蛋白质［53］以及基因［54］的富集、分离和提纯。

目前报道的许多AD相关生物标志物的检测技术都使用IMB 对目标蛋白进行预富集。ADAM10是APP 的α 分泌酶，能够通过裂解APP 来阻止Aβ的生成。研究表明，ADAM10的活性降低与AD病理相关［45］。在此基础上，Faria 等［55］研制了一种用于CSF 和血浆中ADAM10 检测的微流控平台（图3）。研究者首先使用羧基活化的免疫磁珠偶联抗体，捕获血浆样本中的ADAM10，然后使用磁分离的方法将富含ADAM10 的免疫磁珠从血浆中分离出来，用于后续的检测工作。与传统的酶联免疫吸附法（enzyme‑linked immune sorbent assays，ELISA）相比，使用该检测方法能够获得更低的检出限（limit of detection，LOD）。

Fig.3 Immunomagnetic capture of ADAM10 in a plasma sample and the detection using disposable microfluidic platform［55］图3 血浆样品中ADAM10的免疫磁性捕获及一次性微流控平台［55］

Tao 等［56］在使用滚环扩增电化学发光分析法检测血浆中的Aβ40 和Aβ42 时，也使用了IMB 对目标蛋白进行预富集。在进行电化学分析之前，使用抗体功能化的IMB 捕获血浆样本中的Aβ。该方法获得的Aβ40 和Aβ42 的LOD 分别是1.99 ng/L 和3.14 ng/L。此外，免疫捕获还可以应用于目标蛋白的荧光检测。Li等［57］使用氨基功能化的磁性纳米颗粒和磁性纳米棒偶联不同抗体，分别捕获CSF中的Aβ42 以及tau 蛋白。在进行荧光分子标记后，用全内反射荧光显微镜的电子倍增电荷耦合器件（electron‑multiplying charge‑coupled device，EMCCD）成像系统采集荧光信号，对CSF 中的Aβ42和tau蛋白进行定量分析。IMB的使用实现了对Aβ42和tau蛋白的预富集和纯化，减少了CSF中其他成分对检测信号的干扰，这大大提高了检测的灵敏性和准确性。

2.2 纳米生物传感器的信号转导与增强

生物传感器是能够将生物反应转化为可测量信号的装置，因其具有分析速度快、成本低、操作简便等优势，成为生物医学领域十分有前景的疾病诊断辅助工具［58］。纳米技术的发展促进了生物传感器的构成和性能提升［59］。纳米材料和纳米技术不仅可以促进生物信号转换为可以量化的光电信号，而且可以凭借自身优异的理化性质来提高生物传感器的灵敏度，进而降低检测极限。纳米技术与生物传感器的融合为AD生物标志物的检测提供了更灵敏、更精准、更稳定的检测平台。

2.2.1 电信号调控

电化学传感器是生物传感器领域的一个重要分支。电极与导电溶液接触时会发生生物化学反应，电化学工作站通过监测该过程的电流、阻抗和电导率的变化对分析物进行定量检测［2］。

循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）是一种最常用的电化学分析方法。该方法主要是通过监测溶液中发生的氧化还原反应实现对分析物的检测，在AD 早期生物标志物的检测中也有实用价值。例如，Costa‑García等［60］在金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs）修饰的丝网印刷碳电极上通过链霉亲和素‑生物素偶联Aβ42，随后加入Aβ 42和Aβ42抗体的混合溶液。由于抗体的结合位点有限，溶液中的Aβ42和电极上的Aβ42参与竞争反应。当反应达到平衡后，加入碱性磷酸酶耦合IgG抗体（Anti‑IgG‑AP）以及3‑吲哚基磷酸盐与银离子的混合物（3‑IP/Ag+）。在碱性磷酸酶催化作用下，溶液中发生酶促银沉积反应，Ag+被还原成Ag0。此时进行CV 扫描，溶液中的氧化还原反应会引起峰值电流的变化，峰值电流的强度即可反映溶液中Aβ42 的浓度。研究结果表明，该免疫传感器在为0.5～500 μg/L 范围内可以对Aβ42 进行有效检测，LOD为0.1 μg/L。

电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）是另一个应用比较广泛的电化学分析方法。Qin 等［61］制备了一种基于姜黄素的非酶电化学传感器检测Aβ 寡聚体（Aβ oligomer，AβO）。该工作利用姜黄素‑镍配合物修饰电极，镍的存在增加了姜黄素的导电性。AβO 能够阻碍电极表面的电子传递，导致电子转移电阻明显增加。实验结果表明，在0.001～5 nmol/L的范围内，姜黄素传感器阻抗响应与AβO 的浓度呈现良好的线性对应关系。

方波伏安法（square‑wave voltammetry，SWV）是一种快速、灵敏的电化学定量分析方法。SWV 可以用于AD 生物标志物tau441 的灵敏检测。Guo 等［62］使用化学剥离的单层还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）修饰的电极进行tau 蛋白抗体功能化，随后用于检测AD 患者血清样本中的tau441。tau441与电极表面抗体结合从而阻断了电子的传递，因此随着tau 蛋白浓度增加，SWV 峰值电流逐渐降低。该电化学传感器在0.08～80 pmol/L的浓度范围内与tau441的浓度有良好的线性关系，LOD为75 fmol/L。

差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）在物质痕量检测分析中有着广泛的应用。因其能够降低背景的电流信号，表现出更高的灵敏度和更低的检出限。Guo 等［63］研发了一种基于tau 蛋白抗体功能化金电极的电化学传感器，用于检测AD 患者血清样本中的tau381。为了实现信号的进一步放大，研究者还制备了一种基于AuNPs的生物偶联体，从而形成抗体‑蛋白质‑生物偶联体的三明治结构。AuNPs 增加了电极表面的电子转移效率，从而提高了DPV 电流峰值，进而起到信号放大的作用。该传感器在0.5～100 μmol/L 范围内能够实现对tau381 的灵敏检测，LOD为0.42 pmol/L。

2.2.2 光信号转化

光学生物传感器能够将生物反应转化为吸收、反射、散射和荧光等可量化的光学信号［2］。目前已经发展了基于不同光学传感技术的生物传感器，用于检测蛋白质、核酸和胆固醇等生物分子。表面等离激元共振（surface plasmon resonance，SPR）是一种重要的光学检测技术，其工作原理是基于折射率（refractive index，RI）的变化来实现生物分子间相互作用的分析［64］。当生物分子与SPR 传感芯片有结合时，芯片表面的质量增加引起RI的变化，进而SPR 角也随之发生变化。因此SPR 角的动态变化即可反映生物分子间相互作用的特异性信号。SPR具有高通量、高灵敏度、无标记和实时监测等优点［65］，因此其在生物传感检测方面具有广泛的应用。金纳米薄膜和银纳米薄膜是制备SPR传感芯片的常用材料，它们在近红外和可见光范围内能够产生强烈的等离激元共振［66］。由于金纳米薄膜具有很好的化学稳定性和生物相容性，因此在SPR传感器中更为常见。

借助金纳米薄膜基底的SPR 传感芯片，Homola课题组［67］实现了对CSF中tau‑Aβ复合物的灵敏检测。首先，端基为COOH‑和OH‑的硫醇分子在金基底上形成混合自组装单分子膜（self‑assembled monolayer，SAM），然后通过氨基偶联的方法将tau蛋白抗体修饰在SAM上制备SPR传感芯片。为了放大传感器的检测信号，研究者引入了AuNPs，实验结果显示，AuNPs能够显著增加不同浓度tau‑Aβ 样本的信号差异。该传感器对CSF 中tau‑Aβ复合物检测的LOD为0.1 pmol/L。

为了提高受体与标志物的亲和力，进而提高传感器的特异性，近年来逐渐发展了抗体的替代品。例如，Yang课题组［68］使用类肽纳米片层修饰的表面等离激元共振成像（SPR imaging，SPRi）传感器实现对血清和血浆中Aβ的高灵敏高特异性检测。具有识别环的类肽分子在外力作用下形成紧密堆积的纳米片层（图4），该纳米片层能够模拟抗体的功能，纳米片层起到支撑作用，表面的识别环能够与Aβ 发生特异性结合，从而产生SPR 响应信号。与抗体识别相比，类肽纳米片层具有更高的稳定性和更低的成本，并且在区分对照组和AD组血液样本时，二者的信号差异更为显著。实验结果证明，该传感器在区分对照组、MCI与AD组样本时具有良好的效果，LOD低至皮摩尔级别。

Fig.4 Schematic illustration of the detection of Aβ42 in the serum or plasma by the loop-displaying peptoid nanosheets in combination with surface plasmon resonance imaging［68］图4 环状类肽纳米片结合表面等离子体共振成像（SPRi）检测血清或血浆中Aβ42的示意图［68］

纳米技术的发展为传感器性能优化奠定了基础。近年来，在SPR技术的基础之上，逐渐发展了另一种具有更高灵敏度的检测技术，局域表面等离激元共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）技术［69］。与SPR类似的，该方法主要是通过检测金属纳米结构上RI的变化引起共振波的偏移来检测生物分子［70］。与SPR不同，LSPR传感芯片表面不是金属薄层，而是均匀分布的金属纳米结构，例如金纳米球［71］、金纳米星［72］和金纳米棒［73］等纳米结构。由于金属纳米结构和周围介质之间界面处的RI变化会引起共振波长更大的偏移［70］，因此LSPR具有更高的灵敏度。

以均匀分散的AuNPs单层为基底，Ly等［74］制备了一种LSPR 传感平台，用来检测AD 生物标志物蛋白Aβ42。在链霉亲和素的帮助下，生物素功能化的Aβ42 单克隆抗体被固定在AuNPs 的Langmuir‑Blodgett（LB）膜上，用于捕获Aβ42。该传感器能够检测到CSF 中微量的Aβ42，低至1 μg/L。

除了使用单一形状的AuNPs，根据纳米颗粒的形状不同，LSPR 还可以对不同的生物标志物进行识别和检测。在此基础上，Kim 等［75］制备了一种形状编码的LSPR生物传感器，用于检测模拟血浆中的Aβ40、Aβ42以及tau蛋白。3种不同形状的AuNPs 分别对Aβ40、Aβ42 以及tau 蛋白的抗体功能化，用于捕获溶液中相应的生物标志物。随后，研究者以不同的转速对混合溶液进行离心，将分离产物分别进行LSPR 分析。该传感器对3 种生物标志物检测的LOD都达到了飞摩尔级别。

与LSPR 类似，拉曼光谱也是一种可以用于AD生物标志物检测的光学传感技术。拉曼散射效应本身的信号很弱，仅占整个散射光的千分之几，因此很难将其直接应用。有研究者发现，粗糙表面能够将其表面分子的拉曼光谱信号提高102～106倍［76］，这种效应被称为表面增强拉曼（surface‑enhanced Raman spectroscopy，SERS）效 应。SERS 包含分子的拉曼散射信息，通常称之为“拉曼指纹”［77］。“拉曼指纹”可以用来识别目标蛋白，拉曼信号的强度则可以实现目标蛋白的定量分析。

SERS 是一种很有前途的生物分析传感平台，研究者已经将SERS 应用于AD 早期生物标志物的检测。为了进一步提高SERS的检测性能，通过利用特殊纳米结构来增加表面粗糙度，进而提高SERS 信号增强因子是一种有效途径。Kim 等［78］使用一种银纳米间隙（silver nanogaps，AgNGs）作为纳米探针，通过SERS 来检测血液中的Aβ40和Aβ42。在进行AD 生物标志物检测时，首先构建免疫磁珠‑目标蛋白‑AgNGs的三明治结构，利用免疫磁珠将其从血清样本中分离出来，而后进行SERS分析。研究结果表明，AgNGs增加了原本银纳米颗粒（silver nanoparticle，AgNPs）的表面粗糙度，使SERS 信号强度增强高达7 个数量级，该传感器的LOD可以低至0.25 μg/L。

仅靠肉眼观察来区分正常人、AD患者以及其他痴呆患者的SERS谱图是不可靠的。近几年，人工智能的迅速发展为提高AD早期诊断的准确性带来了新的希望。例如，Lednev 等［79］报道了一种SERS 与多元统计分析相结合的方法，借助人工神经网络（artificial neural network，ANN）对AD 患者血清样本进行SERS谱的分析和分类，诊断灵敏度可以达到98%。

此外，电化学发光技术也可以实现AD生物标志物的灵敏检测。电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）是在氧化还原反应中，发光基团通过电化学诱导产生光的过程［80］。ECL 传感器可以通过数值变化来反映电极上的电荷转移，从而定量分析待检测物的浓度。钌（Ru）配合物是一种重要的电致发光材料，在光电传感器中有广泛的应用。Da 等［81］将其应用于Aβ42 聚集体的免疫检测，开发了一种无标签的纸基生物传感器。在该传感器中，［Ru（phen）2dppz］2+与Aβ42 聚集体键合后与溶液中的三丙胺发生氧化还原反应，导致电化学发光，最终的光信号由纸基双电极电化学发光检测系统采集输出，该方法可检测到100 pmol/L Aβ42。石墨氮化碳纳米片（graphitic carbon nitride nanosheet，g‑C3N4NSs）具有良好的ECL 性质，并且具有比表面积大、导电性好和生物相容性高的优点，在ECL 传感器领域有良好的应用前景［82］。Deng 等［83］以AgNPs 改性的g‑C3N4NSs 和Ru（bpy）32+掺杂的TiO2纳米颗粒为发光元件（图5），制备了一种用于检测Aβ42的双波长比率电化学发光传感器。两组发光元件分别在不同波长表现出稳定的ECL 信号，使用两个信号的比率作为检测信号有利于排除外部的干扰，进而提高检测的可靠性。该传感器检测Aβ42 的线性范围为1×10-5至200 μg/L，LOD为2.6 ng/L。

2.3 检测灵敏度的提高

碳纳米材料，例如石墨烯（graphene）、碳纳米管（carbon nanotubes，CNTs）、碳纳米纤维（carbon nanofibers，CNFs）等，具有良好的光学、电学以及力学性能，在能源、检测和药物递送等领域具有重要的应用价值［84］。其中，石墨烯是一种极具影响力的碳材料，它是由单层碳原子排列成六角形或蜂窝状晶格的二维碳纳米材料，具有比表面积大、生物相容性好以及易于表面功能化等优点［85］，对于提高检测灵敏度非常有利，因此在纳米生物传感器领域有很大的实用价值。

借助石墨烯的优良性质，Hwang 等［86］制备了一种氧化石墨烯场效应晶体管（graphene oxide field effect transistor，gFET）生物传感器，对血浆中的Aβ42和tau蛋白进行超灵敏和多重检测。还原氧化石墨烯（reduced graphene，rGO）为抗体的固定提供了大量结合位点，这大大增强了传感器捕获Aβ42和t‑tau（总tau蛋白）的能力，进而提高了检测的灵敏度。Awan 等［87］报道了另外一种用于检测AD 的重要生物标志物凝聚素（clusterin）的gFET。该研究使用1‑戊二酸丁二酰亚胺酯作为连接分子，将凝聚素抗体连接在退火石墨烯表面。实验结果表明，该传感器的最低检出限为4 fmol/L。

Fig.5 Schematic illustration of preparation of dual-wavelength ratiometric electrochemiluminescence sensor［83］图5 双波长比率电化学发光传感器制备示意图［83］

CNTs 是由石墨烯卷曲形成的管状结构，可分为单壁碳纳米管（single‑walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳纳米管（multi‑walled carbon nanotubes，MWCNTs）。碳纳米管拥有与石墨烯类似的性质，已经被用于AD 早期生物标志物的检测。例如，Park 等［88］研制了一种基于SWCNTs 薄膜的生物传感器，用于同时检测人体血浆中t‑tau、p‑tau181、Aβ42 和Aβ40 4 种AD 核心生物标志物。首先使用LB 膜方法制备了单层碳纳米管薄膜，通过反复施加外力让所获得的单层碳纳米管紧密堆积，单向排列（图6）。紧密堆积的SWCNTs 结构为抗体的偶联提供了更多有效活性位点，与随机排列的碳纳米管相比，可以将传感器的检测灵敏度提高1.88倍。

MWCNTs 也可以应用于AD 生物标志物的检测。Yu 等［89］设计了一种用夹心法检测Aβ 分子的高灵敏度的生物传感器。该方法是以MWCNTs 和AuNPs 为基础，依靠明胶蛋白来捕获AD 大鼠CSF和脑组织中可溶性Aβ40 和Aβ42。一方面，MWCNTs 能够加速电子的转移；另一方面，巨大的比表面积为明胶蛋白提供更多的附着位点，这大大提高了检测灵敏度。数据结果显示，使用碳纳米管能够将电信号响应至少提高1倍［90］。

2.4 AD纳米检测技术的临床价值

AD 生物标志物检测平台的构建以及性能优化最终是为了满足临床应用的需求。临床价值的体现是众多传感检测平台面临的巨大挑战。近年来，以纳米技术为基础的检测平台，在AD 的预后判断、疗效评估以及早期诊断等方面都显现了实际应用价值。

2.4.1 疾病的预后判断和疗效评估

以纳米科学为基础的体外诊断技术具有操作简单和便于携带的优点，能够实现对生物标志物的实时监测。例如，Singh 等［91］开发了一种用于同时检测Aβ40和Aβ42的生物传感芯片。该芯片连接了便携式读取器并且将其与移动手机应用程序相结合，用于数据的分析和采集。尽管该设备并没有应用于真实样本的分析，但是提供了一种可视化AD生物标志物的实时监测方法，可能用于药物疗效的评估。

Fig.6 Schematic illustration of a densely aligned CNT sensor array for AD biomarkers［88］图6 AD生物标志物密集排列的CNT传感器阵列示意图［88］

尽管AD 治疗药物的研发工作［92‑95］从未停止，但目前依然没有能够治疗AD的特效药物。目前已有AD治疗药物的有效成分主要都是乙酰胆碱酯酶抑制剂（acetylcholinesterase inhibitors，AChEIs）［96］，因此，检测药物对乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的抑制效果在药物的研发过程中至关重要。rGO的能带结构中，其布里渊区边界的高对称点上存在具有线性色散关系的上下锥形结构，这些锥形结构的顶点称之为狄拉克点。狄拉克点的位移变化可以用来评估rGO 表面发生的化学反应。在此基础上，Hwang等［97］制备了一种AChE 功能化的gFET。AChE 与乙酰胆碱（acetycholine，ACh）之间的酶催化反应会引起狄拉克点位移，从而可以推断溶液中ACh 的浓度。作者使用该设备验证了两种常见的AChE 抑制剂，多奈哌齐和卡巴拉汀对AChE 有明显的抑制效果。该工作提供了一种乙酰胆碱的检测方法，并在药疗效评估方面具有一定的应用价值。

2.4.2 疾病的早期诊断

到目前为止，由于AD 的致病机理尚不清晰，临床上针对AD 的治疗方法只能延缓而不能阻止AD的发生。如果能够在MCI期甚至临床前期识别AD 风险人群，将对后续的治疗有重要的指导意义。

由于rGO 具有良好的稳定性和生物相容性，常被用于构建生物传感器，对AD血液样本进行分析。Hwang 等［98］制备了一种依赖于电阻变化的rGO传感器。为了评估传感器的检测性能，作者应用该传感器检测血浆分离细胞外囊泡中的Aβ42，结果表明rGO传感器在区分AD患者和正常对照组的临床样本时显示出显著的信号差异（P<0.001），这说明该传感器在AD 诊断方面具有临床应用潜力。

基于SWCNTs的生物传感器也可以用于AD患者血液样本的分析。Kim 等［88］借助紧密堆积的SWCNTs薄膜生物传感器，提供了一种基于血液样本的多靶点检测方法。通过测量血液样本中t‑tau/Aβ42、p‑tau181/Aβ42和Aβ42/Aβ40的检测信号值，该传感器能够实现临床诊断中AD患者与健康对照组的区分。该传感器的平均灵敏度为90.0%，选择性为90.0%，平均准确率为88.6%。

目前已经有许多纳米检测技术应用于临床样本的分析，要想应用于对临床样本进行AD疾病进展的判断，早日实现AD的早期诊断，还需要进一步提高检测器灵敏度、准确性等检测性能。

3 总结与展望

尽管人们对AD致病机制进行了长达近百年的探索，目前依然无法对AD 有一个透彻清晰的认识。这也是阻碍AD 特效药物研发的一个关键因素。已经获得批准的AD治疗药物主要是用来延缓AD 疾病进展，而不能从根本上阻止AD 进展，因此，AD的早期诊断显得至关重要。在众多检测方法中，纳米体外诊断技术具有显著的优势。纳米技术不仅能够将检测信号转换成光学、电学等易于检测的信号，而且还能通过纳米材料本身的性质优化检测设备的性能。

近年来报道的检测方法主要聚焦于检测灵敏度的提高，要想在CSF和血浆这样成分复杂的体系中实现AD生物标志物的精准检测，提高检测灵敏度仍然是一个值得关注的话题。越来越多的研究结果表明，对单一生物标志物的检测无法实现对AD进展的准确判断。为了提高检测的准确度，目前的研究方向逐渐从仅针对单一靶点的检测过渡到多个靶点的同时检测。另外，要想在CSF和血液等复杂的体液中准确定量生物标志物，受体的特异性识别能力也是影响检测性能的关键因素。目前已经发展了多肽、类肽、核酸适配体等可替代抗体的受体识别分子。未来还需要开发更多特异性更强的受体识别元件。同时，在进行复杂体液的检测工作中，传感器的信号稳定性、重现性有待进一步研究。为了将目前的检测技术早日应用于AD的临床诊断，除了提高检测灵敏度之外，诊断灵敏度也是一个值得关注的因素。人工智能的兴起，提供了一种更为准确的AD 诊断辅助工具。为了更好地实现AD 的预后判断，实时追踪AD药物的治疗效果，小型化、集成化的传感芯片有待开发。纳米技术、微流控技术、芯片制造技术和人工智能技术等的有机结合将推动AD 体外诊断技术的快速发展，AD 早期诊断有望成为现实。