金抗体替代ELISA中的天然抗体用于溶菌酶检测*

许艳娇 李文浩 高天歌 曹傲能*

（上海大学纳米化学与生物学研究所，上海 200444）

酶联免疫吸附测定（ELISA）最早由Engvall和Perlmann 于1971 年开发出来［1］。ELISA 可用于抗体、抗原（包括蛋白质、多肽和其他分子）的检测和定量。经历一系列优化开发、自动化和商业化［2‑5］，ELISA 已成为世界各国研究和诊断实验室的常规方法［4，6‑7］，广泛应用于疾病诊断［8］、食品安全检测［9］、环境检测［10］等领域［11‑12］。

随着ELISA 在临床、食品安全和环境等领域发挥着越来越重要的作用，现在几乎所有的实验室在分析时都直接或间接地使用ELISA［9］。在正确严谨的操作下，ELISA可以为科学研究和临床诊断提供高度可重复的定量数据。然而，ELISA的检测完全依赖于抗体的活性，而天然抗体固有的不稳定缺点也给ELISA 检测带来一系列问题。首先，特异性单克隆抗体的生产仍极具挑战性［13］，抗体生产的批次不同就可能造成抗体的活性区别和检测结果的差异。此外，作为天然蛋白质的抗体可能会由于温度、pH 或化学诱导的变化而失去其活性［14‑15］。这些缺点都在一定程度上限制了ELISA 的应用范围和环境。

本课题组前期发展了一种构象工程方法［16］，通过将天然抗体蛋白中的互补决定区（CDR）片段嫁接到金纳米粒子（AuNPs）上，并成功在金纳米粒子上重建了CDR片段在原天然抗体中的构象，制备了一种全新的、可像原天然抗体一样特异性识别原抗原的纳米人工抗体，简称为金抗体（goldbody）［16］。其中，抗溶菌酶金抗体就是将天然抗体cAb‑lys3的CDR3区域经适当改造后得到多肽P1，P1肽通过其两端的半胱氨酸以两个Au‑S键连接到金纳米粒子上而制得。尽管自由的P1 肽不具备和溶菌酶结合的能力，经构象重构后得到的抗溶菌酶金抗体可以像天然抗体cAb‑lys3一样与溶菌酶特异性结合，并抑制溶菌酶的活性［16‑17］。根据基于此工作提出的“限域下最低能量结构片段”（CLEF）假说［18‑19］，该技术可以作为一种普适的方法开发更多的识别不同抗原的金抗体。金抗体可以像天然抗体一样特异性地与抗原相互作用，并且具备远优于天然抗体的稳定性［16］。金抗体经煮沸1 h、冷却后仍然保持极大部分活性。Willson 教授在F1000Prime 推荐此工作的文章中［20］，还专门为该技术造了一个新词“goldization”，将其与治疗抗体中的人源化（humanization）相比拟，暗示该技术的广泛应用前景。作为金抗体应用的探索，在此首次研究了以金抗体代替天然抗体用于ELISA 检测，可以克服天然抗体的不稳定性缺点。

ELISA有多种检测类型，其中最简单的就是直接法［21‑23］。直接法直接将抗原固定（包被，coating）在孔板上，而把辣根过氧化物酶（HRP）连接到特异性识别抗原的抗体（一抗）（图1a）。直接法的缺点之一是要把HRP 连接到一抗，检测不同的抗原就需要把HRP 连接不同的一抗，因而生产和使用成本较高。针对这一缺点，间接法（图1b）把HRP 连接到识别一抗的二抗上，由于HRP‑二抗的通用性而降低使用成本。本工作中，金抗体用于ELISA 的方案设计（图1c）参考直接法和间接法原理，针对蛋清溶菌酶（HEWL）抗原，以抗溶菌酶金抗体作为一抗，通过带巯基的PEG 先与HRP 共价连接制得HRP‑PEG‑SH，然后利用HRP‑PEG‑SH上巯基高效与金纳米粒子反应的特性，将HRP‑PEG‑SH 连接到金抗体上。因此，HRP‑PEG‑SH可作为一个相当于HRP‑二抗的产品，具有通用性，可以用于未来不同抗原的检测。因而这一金抗体ELISA 兼具直接法和间接法ELISA 的部分特点和优势。

Fig.1 Schematic diagram of the application of goldbody in ELISA

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

氯金酸、柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸、过氧化氢和氢氧化钠购于国药集团化学试剂有限公司（中国）。1‑乙基‑（3‑二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。巯基聚乙二醇羧基（HS‑PEG（5K）‑COOH）购于上海芃硕生物科技有限公司。溶壁微球菌购于生工生物工程上海股份有限公司。鸡蛋清溶菌酶（HEWL）、核糖核酸酶A（RNase A）、牛血清白蛋白（BSA）和辣根过氧化物酶（HRP）购自Sigma‑Aldrich（美国）。检测溶菌酶ELISA 试剂盒（F81004‑A）购自凡科维公司（上海）。多肽P1（其氨基酸序列为CGSTIYASYYESGHGC）由上海科肽生物技术有限公司合成。紫外可见光谱于U‑3010 型光谱仪（日本HITACHI公司）上测定，电镜照片于HT7700（透射电子显微镜日本Hitachi 公司）上拍摄，ELISA 检测于Varioskan Flash 多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）上进行。

1.2 聚乙二醇耦联辣根过氧化物酶

使用经典的EDC‑NHS 反应将HS‑PEG（5K）‑COOH 与HRP 耦联。具体步骤如下：分别称取1.2 mg HS‑PEG‑COOH 溶于6 ml 磷酸盐缓冲液（40 mmol/L，pH 7.4），称取10 mg NHS 溶于50µl超纯水，称取10 mg EDC 溶于50µl 超纯水，称取8 mg HRP 溶于2 ml 超纯水。在4℃搅拌下，将30µl EDC溶液滴加至5 ml HS‑PEG‑COOH溶液中，避光反应10 min后，加入30µl NHS溶液避光反应30 min，将2 ml HRP 溶液滴加至混合溶液，避光反应过夜。反应完毕后使用截留分子质量为10 ku的超滤管，在10ºC 300 r/min 的条件下离心超滤除去未反应物，并用磷酸盐缓冲液洗涤3次，将所得上清液进行冷冻干燥，得到最终产物即为HRP‑PEG‑SH。

1.3 酶标金抗体的合成与优化

金纳米粒子的合成：课题组前期抗溶菌酶金抗体的工作主要利用3.6 nm 的金纳米粒子合成，因为尺寸小的金纳米粒子可以有更高的摩尔浓度［16］。本工作中，首先测试了3.6 nm 金抗体的适用性（附件图S1～S4），最终选择了13 nm金纳米粒子。13 nm金纳米粒子按如下方法合成：在500 ml圆底烧瓶中加入240 ml超纯水及25 ml 39.47 mmol/L柠檬酸三钠溶液后置于120ºC 恒温油浴中。冷凝回流，反应20 min 后，迅速加入10 ml 25 mmol/L 氯金酸溶液。均匀搅拌约5 min 后取出，自然冷却至室温，即得13 nm金纳米粒子（附件图S5～S8）。

金抗体的合成与优化：根据课题组前期工作，多肽可通过Au‑S 键高效固定在金纳米粒子表面［16］。为确定13 nm AuNPs 表面可耦联P1 多肽的最大数量，将过量P1与AuNPs反应，利用P1的固有荧光，检测超滤后未反应的游离肽（附件图S9），平均每个AuNP上耦联P1的最大数量为679，即多肽密度优化时上限是679。首先将制得的13 nm 金纳米粒子使用0.22µm 过滤膜除去可能的大颗粒杂质。然后将10µl 0.2 mol/L柠檬酸三钠溶液加入到6 ml 过滤后的AuNPs 中，室温下搅拌均匀。接着将2 ml 不同浓度的P1 多肽溶液（根据吸光度定浓度，多肽P1 消光系数为2.706 L/g）逐滴加入至上述溶液，避光搅拌反应过夜，即可得到不同多肽密度的抗溶菌酶金抗体。最后通过金抗体抑制溶菌酶活性实验确定最佳多肽密度。

酶标金抗体的合成与优化：酶标金抗体采取与制备金抗体相近方法，从金纳米粒子直接合成。先将1 ml 多肽溶液（按照优化浓度后的浓度）逐滴滴加到AuNPs 与柠檬酸三钠溶液混合溶液中，室温下避光反应1 h 后，将不同浓度的1 ml HRP‑PEG‑SH 溶液逐滴滴加至上述溶液中，同样通过Au‑S 键将HRP‑PEG‑SH 固定在金纳米粒子表面，避光搅拌反应过夜，即可得到酶标金抗体（HRP‑（Au‑400P1））。同样通过金抗体抑制溶菌酶活性实验确定每个金抗体上的最佳HRP个数。

1.4 溶菌酶活性检测

HEWL 的酶活性是以溶壁微球菌为底物的比浊法来确定，通过使用紫外‑可见分光光度计检测在450 nm 处的动态吸光度来测定［16］。底物储备溶液是将溶壁微球菌分散到磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.2）中。HEWL 储备溶液同样在磷酸盐缓冲液中制备。测定方法是将0.5 ml的HEWL溶液添加到1 ml 的Au‑P1 或HRP‑（Au‑400P1）溶液中并充分混合1 min。然后将1 ml 底物溶液加入到混合物中。剧烈振荡以混匀后，将混合物迅速转移到比色皿中进行吸光度测量。所有样品和测定均在25ºC 下进行。180 s 内吸光度变化与时间的斜率代表HEWL的活性。在抑制剂的作用下，测量斜率与游离HEWL 斜率之间的比值表示HEWL 的相对活性，相对活性的丢失即为抑制剂对HEWL 的相对抑制率。

1.5 酶标金抗体在ELISA中的应用

按照图1c 的设计方案，以酶标金抗体进行了溶菌酶的定量检测。参照了标准的ELISA 直接法检测步骤，并进行实验条件的优化。实验用96 孔板，在Varioskan Flash多功能酶标仪上进行。同时用酶标天然抗体按标准的ELISA 直接法检测进行对照。

为检验酶标金抗体ELISA 法在复杂溶液条件中检测溶菌酶的效果，本实验采取加标回收的方法，以已知浓度HEWL 混合高浓度的杂蛋白作为测试样品。我们选择与HEWL 性质相似的带正电的RNase A 和血液中大量存在的带负电白蛋白（BSA）作为代表性杂蛋白。先分别配置HEWL、RNase A和BSA纯溶液，并通过测定吸收度确定三者各自的浓度。然后按一定比例混合得到加标样品。最终样品中HEWL 的浓度分别为1.5、4.6、10 mg/L，对应的RNase A 浓度为HEWL 浓度的10倍即15、46、100 mg/L，对应的BSA 设置为HEWL 浓度的100 倍即150、460、1 000 mg/L。将三个样品分别以传统直接法和酶标金抗体直接法来进行加标回收测定，分析测定值及加标回收率。

1.6 检测蛋清中的溶菌酶

为检验酶标金抗体ELISA 法对于真实样品中检测溶菌酶的效果，我们对鸡蛋蛋清中溶菌酶进行了检测。将鸡蛋打碎并将蛋液混合物置于烧杯中，使用注射器人工将蛋清分离出来，使用20 mmol/L pH 9.2 碳酸盐缓冲溶液稀释，最后使用20 mmol/L pH 10.7 碳酸盐缓冲溶液将稀释液配制为最终的待测样品，测定蛋清稀释液中的溶菌酶含量，同时使用传统ELISA 法直接法对蛋清稀释液进行测定，分析两种方法的测定值以及蛋清中溶菌酶的总含量。

2 结果与讨论

以粒径约3.6 nm AuNPs 为骨架的抗溶菌酶金抗体（附件图S1～S3）虽然具有很好的特异性结合溶菌酶的能力，并得到较为详尽的研究［16‑17］。但可能由于HRP 标记后，对3.6 nm 金抗体有遮蔽金作用，大大降低金抗体活性（附件图S4），因此本文重点选择粒径较大的AuNPs（～13 nm，图2a，b）作为骨架。首先通过金抗体抑制溶菌酶活性实验确定13 nm AuNPs上最佳P1多肽的密度。结果显示，当平均每个金纳米粒子上连接450 条P1 多肽时，金抗体对HEWL酶活性抑制率最高（图2c）。考虑到在金抗体表面耦联HRP时需要挤占一部分位点，因此选择平均每个金纳米粒子上连接400 条P1 多肽作为最佳耦联密度。

然后在平均每个金纳米粒子上耦联400 条P1多肽基础上，耦联不同数量的HRP，得到HRP‑金抗体耦联物（图3a）。同样通过金抗体抑制溶菌酶活性实验来检测耦联HRP 对金抗体识别溶菌酶的影响。结果显示，在平均每个金抗体表面耦联10个以内的HRP 后，金抗体仍然可以较好地抑制溶菌酶的活性（图3b）。

下一步，用制得的不同HRP 耦联量的酶标金抗体代替天然抗体，初步探索用ELISA 法定量测定溶菌酶含量实验。实验结果显示（图4），和预期一样，金抗体表面耦联HRP 越多，检测到的信号越强；而作为阴性对照的金纳米粒子和没有耦联HRP 的金抗体则没有检出信号。综上结果，最终选定10HRP‑（Au‑400P1）为ELISA用酶标金抗体。

由于抗原包被的质量对后续ELISA 检测有重要影响。因此，对包被HEWL的包被缓冲液pH进行了优化，同时对酶底物反应时间进行了优化（附件图S10）。优化反应条件后，将酶标金抗体代替检测抗体进行探索，确定检测步骤如下：

Fig.2 Characterization of AuNPs and goldbody

a.包被。在96 孔板中，每孔加入对应100 µl不同浓度HEWL（20 mmol/L pH 10.7 碳酸盐缓冲溶液），4ºC静置过夜；洗板并拍干。

b.封闭。在包被后的孔板中，每孔加入200µl 5%BSA（20 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液），室温下振荡1 h；洗板并拍干。

c.结合酶标金抗体。在对应板孔中加入100µl酶标金抗体，室温下振荡反应2 h；洗板并拍干。

d.酶底物反应：加入100µl 现配酶底物（o‑phenylenediamine，OPD，pH 5.5 缓冲盐溶液），避光反应15 min 后，加入100µl 2 mol/L 硫酸终止反应。

e.检测分析：使用多功能酶标仪测定最终反应结果，并对数据进行分析。

Fig.3 Characterization of enzyme-labeled goldbody

实现以上条件和步骤优化后，对一系列浓度的标准HEWL 溶液用ELISA 法进行定量检测，得到了标准曲线（图5a），通过对检测曲线进行拟合，最终得到的浓度曲线方程为：A495nm=3.81-3.75/（1+（c/3.72）2.6（R2=0.99）。A495nm为在495 nm处检测的酶解产物吸光度，c为溶菌酶浓度。从图5a 可以看出，抗溶菌酶金抗体ELISA 的定量检测范围为1～16 mg/L，这与传统ELISA 方法的检测范围相当［24］。

Fig.4 Signal of enzyme-labeled goldbodies with different HRP density

为了和传统的直接法ELISA 比较，以商业试剂盒中的酶标抗溶菌酶天然抗体及配套底物（底物略有不同，对应检测波长有一定变化）绘制传统的直接法ELISA检测溶菌酶曲线（图5a），拟合得到标准曲线方程为：A450nm=0.87-0.82/（1+（c/18.28）1.38（R2=0.99）。通过对比可以看出，金抗体和天然抗体检测范围大致相当，但在检测低浓度溶菌酶时，金抗体ELISA法比传统的直接法ELISA更灵敏。

为进一步确定抗溶菌酶金抗体ELISA 检测HEWL 的特异性，以和溶菌酶大小带电等性质都十分相似的RNase A 来测试该方法的实用性。从图5b 可以看出，和溶菌酶同浓度的纯RNase A 几乎不产生检测信号，而即使用HEWL 5 倍浓度的RNase A和HEWL相混合作为待测样品，检测信号也和同溶菌酶浓度的纯HEWL 检测信号几乎完全一致，从而验证了酶标金抗体对较为复杂环境中抗原的检测能力。

然后，采取加标回收的方法检验酶标金抗体ELISA 法在复杂溶液条件中检测溶菌酶的效果。表1 列出了分别用金抗体ELISA 法和天然抗体ELISA 直接法检测参杂高浓度RNase A 和BSA 的HEWL 样品的检测结果。从结果可以看出，酶标金抗体检测的3 个样品，其回收率均在90%～110%以内，符合检测标准。而且无论是检测值的平均偏差还是样品加标回收率，金抗体ELISA 法（检测值的平均偏差±0.04，回收率平均偏差为+2.3%）都优于天然抗体ELISA直接法（检测值的平均偏差±0.17，回收率平均偏差为−9.4%），因而金抗体ELISA法检测准确度比传统的ELISA直接法更高。

Fig.5 Detection of HEWL by ELISA with goldbody（10HRP-（Au-400P1））or natural antibody

Table 1 Recovery of spiked HEWL samples by goldbody-ELISA and traditional direct ELISA

最后，对真实样品即鸡蛋蛋清中的溶菌酶含量进行检测，以检验酶标金抗体ELISA 法对于实际样品的检测效果。先用两个不同的稀释倍数将蛋清稀释至ELISA 法的检测范围，以验证检测方法的可靠性和实用性（表2）。从表2中可以看出，酶标金抗体ELISA 法对不同稀释倍数的样品检测结果一致性要优于传统ELISA直接法检测结果。同时，检测所得的蛋清中溶菌酶含量与相关文献报道相近［25］。

Table 2 Detection of lysozyme in egg white by goldbody-ELISA and traditional direct ELISA

3 结论

在前期工作基础上，本文首先以13 nm AuNPs为骨架合成和优化了抗溶菌酶金抗体，并制备了可以用于ELISA 检测的酶标抗溶菌酶金抗体10HRP‑（Au‑400P1），可用于定量检测1～16 mg/L范围内的HEWL，检测范围和传统的ELISA方法相当。金抗体ELISA 展示了良好的特异性，实验结果表明，即使和高浓度的、与HEWL 性质极为相似的RNase A混合，也不影响对HEWL的检测结果。加标回收法对比测试结果显示，无论是测量值的平行性还是加标样品的回收率，酶标金抗体ELISA 法都明显优于传统的天然抗体ELISA直接法。当然，金抗体ELISA 还有很大的优化提升空间，比如选择更合适的金纳米粒子尺寸，以及增加HRP 的耦联量。相信经过进一步优化后，可以用于检测更低的抗原浓度。以金抗体代替天然抗体用于ELISA直接法检测，不仅避免了天然抗体稳定性差的缺点，而且10HRP‑（Au‑400P1）作为检测抗体，还具备了部分间接法的优势，即HRP‑PEG 大致相当于间接法中的酶标二抗，且价格低于酶标二抗，既降低了生产成本，也避免了交叉反应。随着未来更多识别不同抗原金抗体的开发，相信可以广泛地使用金抗体代替天然抗体用于ELISA法检测和诊断。

附件PIBB20210293_Figure_S1.pdf 见本文网络版（http://www.pibb.ac.cn或http://www.cnki.net）。