藏药五味姜黄膏药效学及急性毒性分析

丹增次珍，普布扎西，朱星昊，陈计智，吴宗耀

(1.西藏藏医药大学藏医药研究所，西藏 拉萨 850000；2.西藏自治区藏医院药剂科，西藏 拉萨 850000；3.国家中医药管理局监测统计中心，北京 100027)

随着生活水平不断提高，人们对皮肤健康的关注度越来越高。目前，西医治疗皮肤病多以对症治疗为主，常用来治疗皮肤病的激素类药物，虽具有时间短、疗效快的特点，但存在用药依赖性问题。藏医药治疗皮肤病具有独特疗效，已有上千年的历史，荟萃藏民族千年来藏医药系统的理论基础和丰富的临床经验，对皮肤病病因、症状诊疗、预防养颜等独具特色，形成治疗皮肤病的藏药古方秘方。据文献[1]记载，有关藏医治疗皮肤病古籍挖掘到成药古方有959种，经过筛查整理后，有392种单味药，其中矿物药67种、植物药212种、动物药113种，从中选择主要的药物，对药味和化味、功能、古方来源等内容整合后发现，在藏医古籍文献[2]中，治疗朗秀病(湿疹)的五味姜黄膏出现频率19次，加减方法最多，各时期使用普遍，五种药较温和，没有涉及动物药和矿物药，均由草药组成。临床上，五味姜黄膏对湿疹疗效明确，为探讨其作用特点，课题组观察了五味姜黄膏对DNCB诱导小鼠湿疹模型的干预作用以及对家兔皮肤急性毒性作用。

1 实验材料

1.1 动物

BALB/c 小鼠50只，雄性，SPF 级，体质量19～22 g，由山东省济南朋悦动物繁育有限公司提供，合格证号 SCXK(鲁)2019—0003；实验室许可证号SCXK(豫)2020—0004。实验前先将动物适应性饲养7 d，小鼠自由饮水、进食标准小鼠饲料。

新西兰家兔16只，清洁级，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，购于济南西岭角养殖繁育中心，动物合格证号No.1108221911000286，动物中心许可证号SCXK(鲁)20150001，适应性喂养1周后开始实验。饲养条件：温度(26±2)℃，相对湿度(49±5)%，自由进食饮水。

实验动物伦理审查批准编号：DWLL202104100。

1.2 药物

五味姜黄膏由西藏藏医药大学藏医药与高原生物省部共建重点实验室提供。

五味姜黄膏制备：取处方量姜黄、小檗、广木香、止泻木子、烟絮(吐吧)精确称量，粉碎，将药粉过80目筛，以药粉与凡士林的质量比分别为1∶2、1∶4、5∶4配置，凡士林置水浴上加热至熔化，然后加入上述药粉，搅拌均匀，放冷后分装即可。产品批号：20210515A(药物质量浓度为0.4 g/mL)、20210515B(药物质量浓度为0.2 g/mL)、20210515C(药物质量浓度为1 g/mL,供家兔皮肤毒性实验使用)。

1.3 试剂[3-4]

硫化钠[西亚化学科技(山东)有限公司，批号 20200405]；2,4-二硝基氯苯(DNCB)(成都市联合化工试剂研究所，批号 20200428)；丙酮(成都市联合化工试剂研究所，批号 20190328)；橄榄油(贝蒂斯，批号 2021-01-08/L37)；凡士林(成都金山化学试剂有限公司，批号 20201012)；丁酸氢化可的松乳膏(尤卓尔)(天津金耀药业有限公司，批号 202011061)；多聚甲醛(成都市科隆化学品有限公司，批号 20200616)。

1.4 仪器

高速离心机(上海精学科学仪器有限公司，JK-IRC-3H16R1)；半自动洗板机(长春赛诺迈德医学技术有限责任公司，SAR-520B)；酶标仪(赛默飞世尔，Multiskan GO)；电子天平[上海民桥精密仪器有限公司，FA(N)124A]；三频数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ-700VDB)；电动推剪(飞科，FS5806)；数字测微计[基恩士(中国)有限公司，LS-7000]。

2 实验方法

2.1 五味姜黄膏对DNCB诱导小鼠湿疹模型的干预

2.1.1 致敏及激发溶液的制备

精密称取DNCB 1.4 g，用丙酮橄榄油(4∶1)20 mL 溶解，制成 7% DNCB，作为致敏溶液。精密称取 0.05 g DNCB，用丙酮橄榄油(4∶1)10 mL 溶解，制得0.5% DNCB， 作为激发溶液。

2.1.2 DNCB 致敏小鼠模型制备[5-6]

实验前1天，用电动推剪于小鼠背部脱毛约2 cm×2 cm，选取皮肤无破损的小鼠进行实验。将实验用雄性小鼠 50 只，随机选取10只作为空白组，其余40只制备小鼠湿疹模型。

造模：将40只拟制备湿疹模型小鼠脱毛24 h后，用7%高浓度DNCB丙酮橄榄油溶液(体积比为4∶1)100 μL致敏小鼠背部1次，48 h后用50 μL上述溶液加强致敏1次，第5天在小鼠右耳内外侧用0.5%低浓度DNCB丙酮橄榄油溶液20 μL激发1次；空白组小鼠背部、右耳涂抹等量的丙酮橄榄油溶液。

模型判断：第5天完成第1次低浓度DNCB激发12 h后，肉眼观察各组小鼠背部皮损和右耳皮肤变化情况，造模小鼠背部皮肤出现红斑、水肿及渗出液等急性皮炎现象，小鼠右耳出现红肿；而空白组小鼠背部及右耳皮肤光滑、不红肿。造模成功。

2.1.3 给药

将造模成功的小鼠按随机数字表法分为4组，每组10只。分别为模型组、丁酸氢化可的松乳膏组、五味姜黄膏高剂量组、五味姜黄膏低剂量组。第5、10、15、20、25、30天，在各组小鼠右耳内外侧用0.5%低浓度DNCB丙酮橄榄油溶液20 μL各激发1次，每次完成激发24 h、48 h、72 h，模型组不给药，其余3个治疗组分别涂药于小鼠背部及右耳。五味姜黄膏高剂量组0.6 g(0.4 g/mL、给药期间定时定量，每隔1 h涂药1次，每次0.1 g)、五味姜黄膏低剂量组0.3 g(0.2 g/mL)、0.1%丁酸氢化可的松乳膏组0.3 g。

2.1.4 采血及指标检测[7-8]

实验的第15天、第30天，模型组及各治疗组小鼠按照以下标准进行皮损程度计分：0～1分，无红斑、水肿；2 ～3分，红斑、水肿均不明显，轻度水泡渗出液；3～4分， 红斑、水肿较轻，有中度渗出液或角化；4～5分，红斑、水肿明显，渗出液多；5～6分，溃烂，角化结痂。每组小鼠评分取平均值。

末次激发5 h后，采用单盲法电子数显游标卡尺分别测量每组小鼠左右耳中部厚度，并平行测量3次，计算耳肿胀厚度(耳肿胀厚度=右耳厚度-左耳厚度) 。小鼠眼眶取血，分离血清，按照ELISA试剂盒说明书测定血清中IL-6、TNF-α水平。取血后处死，立即取脾脏，称量，计算脾脏指数，脾脏指数=脾的质量(mg)/体质量(g)。

2.2 五味姜黄膏对家兔皮肤急性毒性作用评价方法[9-12]

取新西兰家兔16只，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，将家兔按体质量由低到高编号，按随机数字表法分为4组，即完整皮肤给药组、完整皮肤对照组、破损皮肤给药组和破损皮肤对照组，每组4只。于给药前24 h，实验兔背部脱毛，脱毛面积约150 cm2。将需要被破损皮肤的两组家兔进行破损皮肤造模，实验兔背部脱毛区用75%乙醇消毒，然后用无菌针头在脱毛区划“井”字，以渗血无明显出血为度。脱毛、造模24 h后，在完整皮肤给药组和破损皮肤给药组(各4只)家兔背部脱毛区均匀涂抹藏药五味姜黄膏(1 g/mL)20 g，完整皮肤对照组和破损皮肤对照组(各4只)家兔背部脱毛区均匀涂抹等体积溶媒(甘油、羊毛脂与水的混合物)。 以双层纱布和聚乙烯薄膜覆盖,用无刺激性胶布加以固定。敷药24 h后，用温水洗净家兔背部脱毛区残余药物。立即观察，并连续观察14 d，每日观察2次。观察指标：家兔皮肤、毛发、饮食、二便、呼吸、眼和黏膜的变化、精神状态、四肢活动及死亡情况、局部皮肤变化。评价指标：完整皮肤2组和破损皮肤2组家兔分别于给药前、给药第7天、给药第14天进行称量，以体质量变化值为指标，进行药物急性毒性评价。实验结束，取用药部位皮肤，福尔马林固定，切片，病理观察。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 五味姜黄膏对DNCB诱导小鼠湿疹模型的干预作用

3.1.1 表观指征

对各组小鼠背部皮肤采用盲法计分，五味姜黄膏高、低剂量对小鼠背部皮损组织有良好的愈合作用。给药第15天、给药第30天，小鼠背部皮损情况：丁酸氢化可的松乳膏组明显好转，五味姜黄膏高剂量组、低剂量组均较模型组有明显好转，见图1、图2。

A 空白组；B 模型组；C 丁酸氢化可的松乳膏组；D 五味姜黄膏高剂量组；E 五味姜黄膏低剂量组图1 五味姜黄膏给药第15天小鼠背部皮肤损伤病变情况

A 空白组；B 模型组；C 丁酸氢化可的松乳膏组；D 五味姜黄膏高剂量组；E 五味姜黄膏低剂量组图2 五味姜黄膏给药第30天小鼠背部皮肤损伤病变情况

3.1.2 五味姜黄膏对湿疹模型小鼠皮损积分、耳肿胀厚度的影响

与模型组比较，五味姜黄膏高、低剂量和丁酸氢化可的松乳膏均可降低第15、30 天皮损积分(P<0.01)，可降低小鼠耳肿胀厚度(P<0.01)，各治疗组与模型组比较，差异均有统计学意义。但是，各治疗组间比较，耳肿胀厚度和第15天皮损积分：丁酸氢化可的松乳膏组<五味姜黄膏高剂量组<五味姜黄膏低剂量组，说明丁酸氢化可的松乳膏治疗效果最好，五味姜黄膏高剂量治疗效果次之，五味姜黄膏低剂量治疗效果略差；各治疗组之间比较，差异无统计学意义。但随着实验时间的延长，五味姜黄膏低剂量治疗效果超过高剂量，接近于丁酸氢化可的松乳膏的治疗效果，由此，可将低剂量组的剂量作为五味姜黄膏治疗剂量的参考值。实验结果见表1。

表1 五味姜黄膏对湿疹模型小鼠皮损积分、耳肿胀厚度的影响

3.1.3 对湿疹模型小鼠脾脏指数的影响

与空白组比较，模型组小鼠脾脏指数升高明显，差异有统计学意义(P<0.01)，由此说明小鼠湿疹模型造模是成功的；与模型组比较，五味姜黄膏高、低剂量和丁酸氢化可的松乳膏均可降低小鼠脾脏指数，差异有统计学意义(P<0.01)。各治疗组间比较，差异无统计学意义，见表2。

表2 五味姜黄膏对湿疹模型小鼠脾脏指数的影响 mg·g-1

3.1.4 对湿疹小鼠血清 IL-6、TNF-α水平的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清 IL-6、TNF-α 水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，五味姜黄膏高、低剂量和丁酸氢化可的松乳膏均可降低小鼠血清 TNF-α水平，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，五味姜黄膏高、低剂量可降低小鼠血清 IL-6，但差异无统计学意义，丁酸氢化可的松乳膏可降低小鼠血清IL-6 水平，差异有统计学意义(P<0.05)。各治疗组间比较，差异无统计学意义，见表3。

表3 五味姜黄膏对湿疹模型小鼠血清 IL-6、TNF-α水平的影响 pg·mL-1

3.2 五味姜黄膏对家兔皮肤急性毒性作用评价

3.2.1 对家兔完整皮肤的急性毒性

家兔完整皮肤给药部位与对照组相应部位皮肤状况差异无统计学意义，家兔脱毛部位皮肤均正常。给药组、对照组家兔毛发、饮食、二便、呼吸、眼和黏膜、精神状态、四肢活动等也未见异常。在观察的14 d内，动物正常，无死亡。局部组织病理观测可见，正常皮肤用药后与对照组一致，表皮与真皮层无明显病变，均为正常。给药前，给药第7、14天，完整皮肤给药组与对照组家兔体质量相比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；随着时间延长，两组家兔体质量均见增加，家兔生长正常，在时间影响方面差异有统计学意义(P<0.01)。两组家兔体质量变化见表4。

表4 五味姜黄膏对完整皮肤家兔体质量的影响 kg

3.2.2 对家兔破损皮肤的急性毒性

家兔破损皮肤给药组在洗去残余药物后观察，可见局部有轻度发红、轻度水肿，第2天用药部位皮肤基本恢复正常。对照组洗去甘油、羊毛脂与水的混合物后观察，“井”字无渗血，局部皮肤正常。给药组、对照组家兔毛发、饮食、二便、呼吸、眼和黏膜、精神状态、四肢活动等也未见异常。在观察的14 d内，动物正常，无死亡。从局部组织病理观测可见，破损皮肤给药组与对照组基底细胞均可见少量空泡，棘层细胞可见稍许松解情况，其他未见明显异常。给药前，给药第7、14天，破损皮肤给药组与对照组家兔体质量相比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；随着时间延长，两组家兔体质量均有增加，在时间影响方面差异有统计学意义(P<0.01)。两组家兔体质量变化见表5。

表5 五味姜黄膏对破损皮肤家兔体质量的影响 kg

4 讨论

五味姜黄膏最早出现于《医学四续》第三部《秘诀续》第六十一章皮肤病治法中，该治法认为：姜黄、小檗、广木香、止泻木子、烟絮一起熬膏，能医治黄水疮、白癜风、疥癣以及一切皮肤病。《医学四续》第四部《后续续》搽涂疗法章节中记载：“吐吧(烟絮)，姜黄，小檗，广木香，止泻木子，酪浆配伍，主治黄水疮、皮肤病”。

为了推动藏药现代化和适应目前方便用药的形势，课题组总结了五味姜黄膏的药物组成和药理作用。姜黄中含有多种天然多酚黄色素，具有较强的抗氧化、抗感染作用；小檗主要成分小檗碱，具有抗感染、抗氧化作用；止泻木子是藏医常用的藏药莪杜模牛，在每年9月份采集果实，剥开取出种子,阴干使用，其药性味苦、辛，性寒，具有清热凉血的功能，主治肺热咳嗽、咽喉肿痛、热性腹泻等；广木香藏医叫如达，药用菊科植物广木香的根部，秋季挖根，洗去泥土及杂质，切块晾干使用，其药性味辛、苦，化味苦，性润而湿，具有温胃、行气、止痛、破痞结、生肌等功能，主治胃胀痛、“隆病”、血病、白喉、肺病、“培根”聚滞、热泻、疮口不敛等；烟絮藏医叫吐吧，《晶珠本草》记载吐吧能医治皮肤病。

本研究对 DNCB 诱导小鼠湿疹模型进行干预，验证五味姜黄膏的治疗作用。方中主药姜黄，其姜黄素有用于治疗炎症和感染性皮肤病的研究，并有证据表明姜黄素可能代表了治疗几种皮肤状况的有效药物[13]。由于这些特性，姜黄素已被用作预防和治疗皮肤老化和炎症疾病，如银屑病、感染、痤疮、皮肤炎症和皮肤癌。姜黄素对紫外线 B 辐射引起的慢性皮肤损伤有保护作用[14]。王莉等[15]整理总结了姜黄素在治疗皮肤病方面发挥的多种作用，例如抗氧化作用、抗感染作用、抗纤维化作用和抗病毒作用。臣药小檗所含的小檗碱具有抗感染作用，其抗感染机制是抑制了 TLR-4 介导的 NF-κB 及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路，进而抑制了LPS 诱导的炎症细胞因子的表达[16]。王佳等[17]通过体外干预神经胶质瘤细胞系 U251细胞，发现小檗碱可能作为细胞内TLR-4 和(或)MAPK 信号通路的拮抗剂，通过诱导关键靶标分子 NR4A1表达发挥其抗感染保护作用。广木香煎剂对许兰黄藓菌及其蒙古变种等10种真菌有抑制作用。止泻木子有清热解毒作用。烟絮能够收敛溃烂皮肤。通过五味姜黄膏与丁酸氢化可的松乳膏对DNCB 诱导小鼠湿疹模型干预作用的对照研究，明确了五味姜黄膏在表观指征、皮损积分、耳肿胀厚度、脾脏指数、血清 TNF-α水平等方面具有显著性效果，发现其疗效仅次于丁酸氢化可的松乳膏。虽然由于本实验的局限性，对本方针对湿疹治疗的具体分子机制尚不明确，但仍可证实藏医古籍中五味姜黄膏对皮肤病中朗秀病(湿疹)的治疗作用，为之后藏药五味姜黄膏治疗各种皮肤病的研究打下了扎实的基础。