利用光谱法检测血痕变化时序性研究

曹 娜

（河南警察学院，河南 郑州 450046）

血液主要由血浆和血细胞组成，除了大量水分，还有无机盐、纤维蛋白原、酶、激素等化学基团[1]。血液离体后水分不断挥发，酰胺、脂类、核酸血红蛋白及其衍生物（高铁血红蛋白、高铁血红素原）等化学基团会随客观环境发生变化。血液中的大多数化学基团不断分解，不同物质的分解速率不同，同一物质的不同基团、同一基团的不同振动类型变化趋势亦不相同，这些都会对光谱的吸收效果造成影响。

当前，有多种技术方法用于推断血痕形成时间，如核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA，分为mRNA或microRNA）降解分析法[2]、傅里叶变换衰减全反射红外光谱（Attenuated Total internal Reflectance Fourier Transform Infraredspectroscopy，ATR-FTIR）技术[3]、紫外可见积分球反射光谱法[4]、紫外可见漫反射光谱法[5]、数字图像分析技术[6]等。本研究利用光谱法对血液样品进行检测并对光谱图进行分析处理，以期找到血痕的时序性变化规律。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及材料

1.1.1 实验仪器及工作条件

（1）岛津牌紫外分光光度计，光波波长为250～800 nm。

（2）岛津牌傅里叶红外光谱仪（AIM-9000）。光谱波数：4 000～400 cm-1。测定模式：透过率。变迹函数：Happp-Genzel。分辨率：4.0 R。扫描次数：32。光束：内部。动镜速度：2.8 mm/s。

1.1.2 实验耗材

石英比色皿，医用酒精，灭菌采血针，消毒棉签若干。

1.1.3 实验检材

健康成年男性的新鲜血液：记录志愿者的相关信息（年龄/性别/健康情况），利用消毒棉签沾取酒精对志愿者手指进行消毒，然后使用灭菌采血针对志愿者进行现场采血，采集新鲜血液1 mL。

1.2 方法

打开傅里叶红外光谱仪，调整好实验设备参数；依次进行空白背景扫描和金刚石背景扫描并保存图谱；安装ATR附件；用一次性滴管吸取一滴样本1号血液，滴在ATR金刚石表面；点击样本扫描，待扫描完成后导出实验数据至新建文件夹中；等待10 min后再次点击样本扫描，导出数据；以10 min为间隔进行24小时段间隔扫描。将每次扫描光谱图按照测量时间命名进行编号，保存至文件夹。

打开紫外-可见分光光度计等相关仪器，并打开相关软件，设置好相关参数，进行空白背景扫描，充分预热机器。预热机器30 min后，将抽取的新鲜血液滴在石英比色皿中，放入紫外-可见分光光度计进行检验，保存数据并记录相关事件，等待10 min后再次扫描检材。多次重复实验，记录并保存相关数据。

2 结果与讨论

2.1 实验结果

根据前期预实验的结果，设定好相关实验数据，按照实验方法进行操作，获得稳定的数值。

2.1.1 红外光谱检测血痕实验结果

利用傅里叶红外光谱仪检测新鲜血痕时，利用OPUS软件对出峰点和峰值数据进行提取，血痕的光谱随时间变化。红外光谱检测发现，血痕的变化主要集中在血液滴落后150 min内，血痕光谱图出峰点随时间变化。不同时间光谱图在不同位置的峰形和峰位有一定差异，变化主要集中在波数为1 540、1 650、2 360、3 300 cm-1的附近，如图1所示。

由图1可以看出，血痕的吸收峰较强，随时间变化较为明显。为了直观地展现变化规律，对出峰点和峰值数据进行提取并形成表格（见表1）。

表1 红外光谱图像峰值

图1 150 min内血液红外光谱变化

在波数400～1 000 cm-1，随着时间推移，峰型没有剧烈变化。在血液滴落1.5 h内，该波段曲线比较平稳，波峰未出现强烈变化；随后1.0 h内，吸光度明显下降。在1 000～1 750 cm-1，波峰变化剧烈。在血液滴落2.0 h内，吸光度持续升高。随后0.5 h，吸光度不断降低。在2 300～2 390 cm-1，血液滴落前1.5 h内，吸光度不断升高；随后1.0 h内，吸光度持续降低。在3 000～3 650 cm-1，血液滴落前1.5 h内，吸光度不断提高；随后1.0 h内，吸光度缓慢降低。

2.1.2 紫外光谱实验结果

利用紫外光谱仪检测新鲜血痕发现，血液的变化主要集中在2.0 h内，血痕光谱图出峰点随时间变化。血液形成的图像随时间的变化表现在出峰点数量上，在0～1.0 h内，样本的光谱图像有5个出峰点，为578、543、416、342、275 nm。1.0 h后，血液的光谱图像出峰点数量明显减少，从5个变为4个（342 nm出峰位置消失）。

血液样本的出峰点位置相对固定，一般为578、543、416、275 nm。利用UVWin5紫外软件对数据进行处理，整理4个出峰点的时序性变化（见图2）。虽然出峰点会有一定偏差，但偏差较小，通常出峰点位置偏离1～2 nm，暂且不能排除其他外部环境干扰或仪器本身导致的出峰点位置偏移。

图2 120 min内血液紫外光谱图主要峰位时序性变化

在波长为275 nm的位置，出峰点的吸光度在0.5 h呈现下降趋势，在0.5～1.5 h呈现上升趋势，在1.5～2.0 h呈现稳定状态。在波长为416 nm附近，出峰点的吸光度在0.5 h内呈现明显的上升趋势，在0.5～1.0 h呈现不明显的下降趋势，在1.0～3.0 h呈现稳定状态。在波长为543 nm附近，出峰点的吸光度在0.5 h呈现明显的下降趋势，在0.5～2.0 h呈现不明显的上升趋势，在2.0～3.0 h呈现相对稳定的状态，虽然出现一定波动，但是变化并不明显。在波长为578 nm附近，出峰点的吸光度在最初0.5 h内呈现明显的下降趋势，在0.5～1.5 h呈现不明显的上升趋势，在1.5 h后呈现相对稳定的状态，虽然出现一定波动，但是变化并不明显。出现波动的原因可能是外部环境因素干扰或者实验仪器本身不稳定。

2.2 讨论

对照红外光谱各基团特征峰可以看出，O—H的伸缩震动区位于3 000～3 750 cm-1。Tidball J G[6]指出，在1 657 cm-1附近有极强的液态水O—H及氢键的吸收峰。由此可以看出，变化较为剧烈的1 600～1 700 cm-1和3 000～3 650 cm-1区间血液滴落2.0 h内变化明显，可能是血液中水分大量蒸发导致的结果。N—H的伸缩震动区也位于3 000～3 750 cm-1，C—H的伸缩震动区位于3 000～3 300 cm-1，C—O的伸缩震动区位于1 000～1 475 cm-1，这与血液中水分变化的红外光谱区域重合，水分的剧烈变化影响了血液中其他蛋白质类、酰胺类物质的吸收峰变化。

对照紫外光谱谱图[7]，红细胞和血红蛋白在275、415、540 nm处有特征峰，且随时间推移，在血液滴落初期的0.5 h内吸光度有所变化，后持续反向变化，在1.5 h后呈稳定状态。红细胞单独在575 nm位点有特征峰，但变化与上述位点相似，均是0.5 h内和0.5 h后明显变化，原因可能是血液中水分变化剧烈，红细胞逐渐破裂而出现不同变化。

通过重复实验发现，利用红外光谱仪和紫外-可见分光光度计分析不同人体血痕得到的光谱图像略有不同，峰值也有一定差异，但是不同个体血痕的光谱图像大体曲线和走势基本保持一致。

通过实验可知，在血痕形成的2.0 h内，血痕的光谱图像变化较为明显。2.0 h后，血痕的光谱图像十分稳定，无法通过光谱图像的变化规律确定血痕的形成时间。

3 结论

选取不同仪器对滴落血液的时序性变化进行分析，得到以下结论：人体血液在红外光谱仪和紫外-可见分光光度计的照射下，得到的光谱图具有相对稳定的出峰点。通过红外光谱仪检测发现，出峰点位置在860、1 650、2 350、3 300 cm-1附近。通过紫外-可见分光光度计检测发现，出峰点位置为275、416、543、578 nm。虽然出峰点位置会有一定偏移，但偏移距离在允许偏移范围内。利用红外光谱仪和紫外-可见分光光度计检测血痕，得到的光谱图像变化主要集中在前2.0 h内，2.0 h后光谱图像相对稳定。2.0 h后血痕光谱图峰值产生变化的原因可能是外部环境的改变或仪器本身不稳定。

综上，采用无损分析法检测新鲜血液中不同化学基团的时序性变化趋势，方法简便，特征峰变化明显，后续希望能建立较精确的数学模型推断血痕形成时间，以便更好地研究血痕形成机制。