自发空泡对胚胎发育潜能影响的探究

王明，李丽，张亨德，李博

目前，选择性单囊胚移植已被各生殖医学中心广泛应用，如何准确选择一枚优质囊胚移植是单囊胚移植的核心，更是影响人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)助孕结局的关键。现阶段胚胎质量的评估主要还是依据形态学观察。检索文献发现，关于胚胎发育过程中出现空泡及空泡对胚胎发育潜能的影响研究较少，且其相关机制也未明确[1-3]。有研究通过Time-lapse技术观测发现，空泡在8细胞胚胎期到桑葚胚期阶段发生更为频繁且对后续发育潜能影响更深[4]。因此，本研究对4 355枚胚胎的囊胚培养数据进行了回顾性分析，探讨授精后第4天(D4)出现空泡对胚胎发育潜能的影响，以期发现空泡化对胚胎发育潜能的预测价值，为临床选择移植优质胚胎提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2021年1～6月唐都医院妇产科生殖医学中心行新鲜周期单囊胚移植患者的临床资料，共计658例患者，709个周期纳入本研究。选择D4胚胎作为研究材料，出现空泡的1 391枚胚胎作为空泡组，同期形态正常无空泡的2 964枚胚胎作为对照组。进一步根据空泡化程度将胚胎分为一般空泡组(1 016枚胚胎)和严重空泡组(375枚胚胎)。比较组间的囊胚形成率、可利用囊胚率及优质囊胚率。

1.2 研究方法

1.2.1 治疗方案 体外受精周期中使用GnRH长方案或GnRH拮抗剂方案进行促排卵治疗。B超监测，当主导卵泡直径≥18 mm时，或至少有3枚卵泡直径≥17 mm时，根据激素水平肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(hCG，珠海丽珠)5 000～10 000 IU/艾泽(默克雪兰诺，意大利)250 μg。在注射34～36 h后，B超引导下经阴道取卵。授精方式根据患者病史及取卵日精子质量选择采用常规体外受精(in vitro fertilization，IVF)或卵胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)操作。

1.2.2 胚胎评估 受精后16～18 h评估受精结果，将受精正常的合子放入COOK培养箱内继续培养3～7 d。卵裂胎质量的评估和分类按照下列原则：1级(卵裂球大小均一，没有或者仅有少许碎片≤5%，无空泡)，2级(卵裂球大小不均匀，碎片10%～20%，有空泡)，3级(卵裂球大小严重不均匀，碎片25%，有大量空泡)和4级(卵裂球大小严重不均匀，碎片>50%)。1级和2级被认为是优质胚胎，3级为可利用胚胎。第3天对拟进行囊胚培养的胚胎换液处理。

胚胎评估时观察到卵裂球或胚胎面存在空泡则定义为一般空泡组。当大于或等于1/3卵裂球数出现空泡；或空泡面积占比达到胚胎面的1/3则定义为严重空泡组。

囊胚质量评估：采用 Gardner囊胚评分系统进行囊胚质量评估。根据内细胞团和外滋养层细胞的发育对囊胚进行分级，评级标准如下：① 内细胞(ICM)的发育分为3级：A级为细胞数目多，排列紧密；B级为细胞数目少、排列松散；C级为细胞数目很少。② 外滋养层细胞(TE)的发育分为3级：A级为细胞数目较多，结构致密；B级为细胞数目少、结构松散；C级为细胞稀疏。内细胞团或外滋养层的评分至少有一项达到C级以上为可利用囊胚，内细胞团和外滋养层的评分均在B级及以上的囊胚为优质囊胚。

1.2.3 主要观察指标 分别计算以下指标：囊胚形成率=囊胚形成数/囊胚培养数×100%；可利用囊胚率=可利用囊胚数/囊胚形成数×100%；优质囊胚率=优质囊胚数/囊胚形成数×100%。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

空泡组和对照组在患者年龄、体质量指数(BMI)、基础FSH值、AMH值、Gn用量和获卵数方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 空泡化对胚胎发育潜能的影响

空泡组胚胎的囊胚形成率高于对照组，但优质囊胚率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组的可利用囊胚率差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 空泡化对胚胎发育潜能的影响[例(%)]

2.3 不同程度空泡化对胚胎发育潜能的影响

一般空泡组胚胎的囊胚形成率高于对照组(P<0.001)，但可利用囊胚率和优质囊胚率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。严重空泡组胚胎的囊胚形成率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，低于一般空泡组(P<0.05)。且严重空泡组的可利用囊胚率和优质囊胚率均低于对照组及一般空泡组(P<0.001)。详见表3。

表3 不同程度空泡化对胚胎发育潜能的影响[例(%)]

3 讨论

形态学评分因其具有快捷、经济和无创等优点，是实验室最常用的胚胎筛选方式。已有大量关于卵裂数目、卵裂球均一度、碎片化程度及碎片分布对胚胎发育潜能影响的研究报道[5-7]。而空泡是一种充满水液的球形膜状胞质内含物，作为一种较为常见的胚胎异常形态，在胚胎的各个发育时间均有可能出现。Ebner T等[8]曾报道，空泡可能是滑面内质网或高尔基体的小空泡融合形成，但目前关于胚胎中空泡的形成原因和机制还未明确。

魏玉兰等[9]研究发现，空泡组患者的Gn用量显著高于对照组。Fancsovits P等[10]和Balaban B等[11]研究发现，患者年龄、用药方案及培养环境都会造成胚胎胞质异常，导致空泡形成。但Zhang JY等[4]选择D3和D4胚胎作为研究对象，发现空泡组与对照组患者年龄、基础FSH值及获卵数差异均无统计学意义。Ebner T等[8]也发现两组间年龄、基础FSH值、Gn用量、E2水平、LH水平和P水平差异无统计学意义。本研究结果显示，空泡组与对照组患者年龄、BMI、基础FSH值、AMH值、Gn用量和获卵数比较差异均无统计学意义，与Zhang JY等结果一致。

目前，关于空泡的研究大多都集中在卵母细胞和卵裂期胚胎阶段，对于桑椹胚空泡化的研究较少。卵母细胞内空泡可能会影响细胞骨架功能的发挥，从而显著影响受精和正常的细胞卵裂过程，甚至导致胚胎发育阻滞[12-13]。Balaban B等[11]报道，解冻复苏后卵裂期胚胎的胞质空泡会严重影响囊胚形成，且优质囊胚占比明显下降。Zhang JY等[4]借助time-lapse技术发现，卵裂期胚胎空泡组的囊胚形成率及优质囊胚率均显著低于正常组，可利用囊胚率高于正常组；进一步分析显示两组间种植率差异无统计学意义，但空泡组的流产率显著升高。本研究结果也发现，空泡组的优质囊胚率低于对照组，与前期研究一致，证实了空泡会降低胚胎发育潜能，导致优质囊胚率下降。这可能是因为出现空泡会导致胚胎胞质体积缩小，进而造成形成囊胚的细胞数目减少，影响囊胚质量[13]。此外，本研究还发现与对照组相比，空泡组有更高的囊胚形成率，这与前期研究结果相悖。分析原因可能是，桑葚胚作为囊胚形成前期的独特形态，其致密化阶段又是空泡形成的高峰期，而空泡的形成可能是胚胎致密化后促进融合形成囊胚的一种方式，因而在空泡组反而有更高的囊胚形成率[14]。

关于空泡的研究只分析了其对于胚胎发育有无影响，仅少量文献对空泡化程度进行区分报道。魏玉兰等[9]回顾分析了D5出现严重空泡化胚胎与正常形态胚胎的可利用囊胚率、优质囊胚率及临床结局，发现空泡组的可利用囊胚率及优质囊胚率均低于对照组，但两组间的妊娠率、活产率和流产率差异均无统计学意义。Zhang JY等[4]发现，在一个卵裂球上有空泡对胚胎发育的影响远低于在多个卵裂球上都出现空泡。本研究结果显示，D4胚胎严重空泡组的可利用囊胚率及优质囊胚率均低于对照组和一般空泡组。该结果与前期报道一致，提示可将严重空泡化视为影响胚胎后续发育潜能的不良指标。在胚胎发育的各个阶段，发生严重空泡化的胚胎，可能由于细胞胞质的较大部分会受空泡影响而不能发挥作用，干扰胚胎的正常生长发育，甚至会诱发细胞凋亡，对后续的发育潜能造成极大的损伤[8]。本研究还发现，一般空泡组的可利用囊胚率及优质囊胚率与对照组差异无统计学意义，囊胚形成率却增高，推测D4胚胎出现轻度空泡对后续发育潜能可能并无影响，反而可以一定程度促进囊胚的形成。

挑选高发育潜能的优质胚胎进行移植是ART助孕成功的重要环节[15]，在ART周期中，大部分移植的是卵裂期胚胎或囊胚，很少尝试选择D4的桑葚胚进行移植。但随着技术的不断创造革新及培养液的研发完善，桑葚胚移植逐渐进入人们视野。相关研究发现，D4和D5单胚胎移植的临床妊娠率差异无统计学意义[16-17]，选择D4胚胎移植不仅可以降低因胚胎发育迟缓或停滞而取消移植的风险，还可以一定程度减少体外培养对胚胎带来的表观遗传学改变。鉴于桑葚胚移植的诸多积极方面，如何评估D4胚胎已成为生殖医学热议的话题[14,18-20]。目前，D4胚胎的评估尚无共识，需要从多个方面去论证优质胚胎的评定标准。

综上所述，本研究发现D4一般空泡组胚胎的囊胚形成率高于对照组，严重空泡化D4胚胎的可利用囊胚率和优质囊胚率均低于对照组和一般空泡组胚胎。推测严重空泡化可作为影响胚胎发育潜能的负向指标，在进行胚胎评估时应慎重对待。本研究对预判空泡化D4胚胎的发育潜能，挑选最优质胚胎进行移植有一定参考价值。另外，本研究尚未涉及到空泡化胚胎的临床结局，还需要继续跟踪研究。