超高效液相色谱法同时测定川木香中紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯含量*

王晨虹，商烨，周蕊，李丽，文佳珂，李晋，何俊，常艳旭

（天津中医药大学，天津市中药化学与分析实验室，天津 301617）

中药川木香为菊科川木香属植物川木香Vladimiria souliei（Franch.）Ling或灰毛川木香 V.souliei（Franch.）Ling var.cinerea Ling 的干燥根，主产于四川、重庆等地[1]，具有行气止痛的功效，临床上常用来治疗胸胁、脘腹胀痛、肠鸣腹泻、肝胆疼痛等症[1-2]。现代药理学研究表明川木香具有抗菌、抗胃溃疡、抗炎镇痛、保肝利胆[3-7]等生物活性。川木香的化学成分主要包括倍半萜内酯类、苯丙素类、黄酮类和挥发油类等[1，7]，其中倍半萜类内酯化合物木香烃内酯和去氢木香内酯是其主要活性化学成分，也是2020年版《中国药典》中川木香的质控指标成分[7]，具有抗炎、抗胃溃疡、抗肿瘤、保肝等药理作用[7-11]，苯丙素类化合物紫丁香苷是川木香中含量较高的成分，具有抗炎、护肝等活性[12-15]。研究发现，这3种化合物的药理活性与川木香的药效作用十分相关[7，16]，因此有必要建立川木香中紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯的含量分析方法，进而对其进行合理的质量控制。

目前，研究报道的川木香的定量分析方法主要是通过高效液相色谱（HPLC）法同时测定木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，但是存在HPLC分析时间长等问题[17-19]。超高效液相色谱（UPLC）法具有分析时间短，分离效果佳等优点[20-21]。微波提取法作为新兴的绿色提取技术由于其独特的加热机制和良好的性能具有高效率、高选择性、低成本、绿色环保等众多优点，目前已广泛应用于中药有效成分的提取[22-24]。本研究采用微波法提取，并通过UPLC法检测分析，同时测定了22批川木香中的紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，以期为川木香的质量评价研究提供参考。

1 实验材料

1.1 仪器 Waters Acquity超高效液相色谱仪，配有四元梯度泵、自动进样器、光电二极管阵列检测器（PDA）和Empower 3色谱工作站（美国沃特世公司）；Multiwave PRO型微波消解仪（奥地利安东帕公司）；ZZ-L6DT型超声清洗机（天津知著科技有限公司）；功能高速粉碎机（永康市追梦家居有限公司）；MSX（SD EE）型十万分之一天平（德国赛多利斯公司）；5453型离心机（德国艾本德）；Milli-Q II型超纯水仪（美国密理博公司）。

1.2 试药 对照品紫丁香苷（批号：DST190803-012）、木香烃内酯（批号：DSTDM003001）、去氢木香内酯（批号：DSTDQ004201）均购自成都德斯特生物技术有限公司，纯度均≥98%。乙醇为分析纯，购自天津市康科德科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，均购自于美国Fisher公司。

22批川木香（C1～C22），均产自四川，由天津中医药大学中医药研究院常艳旭教授鉴定为正品，粉碎后过65目筛，密封保存于阴凉干燥处。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱分离采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18保护柱 （2.1 mm×5 mm，1.8 μm）和Agilent ZORBAX Eclipse Plus XDB-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以水（A）-乙腈（B）为流动相，进行梯度洗脱：0～3 min，5%～11.4%B；3～9 min，11.4%～17.8%B；9～15min，17.8%～30.6%B；15～16 min，30.6%～50.4%B；16～19 min，50.4%～50.9%B；19～23 min，50.9%～51.2%B；23～26 min，51.2%～86%B；26～30 min，86%～95%B。柱温为 35℃，体积流量为0.3 mL/min，进样体积 2 μL，检测波长 225 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯对照品适量，加入甲醇，配制成每1 mL分别含紫丁香苷60 μg、木香烃内酯400 μg、去氢木香内酯720 μg的混合对照品溶液，并密封于4℃冰箱中储存备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取川木香粉末50 mg，按液料比 80∶1（mL/g）加入甲醇 4 mL，在400 W功率下微波提取2 min，取出放凉至室温，离心（13 159 g，10 min），取上清液过 0.22 μm 有机微孔滤膜，取续滤液用于UPLC分析。

2.3 微波提取川木香条件的优化

2.3.1 提取溶剂种类的考察 精密称取川木香粉末100 mg于微波萃取管中，分别加入10 mL甲醇、乙醇、乙腈、水作为提取溶剂，于700 W微波下提取10 min，取出放凉至室温后离心（13 159 g，10 min），取上清液经0.22 μm有机微孔滤膜过滤，平行实验3次，UPLC进样分析，结果由软件SPSS 26进行方差（ANOVA）分析。如图1A所示，当以甲醇作为提取溶剂时，紫丁香苷、木香烃内酯、去氢木香内酯的总峰面积最高，因此提取溶剂选择甲醇。

2.3.2 提取溶剂浓度的考察 控制微波提取其他条件不变，考察提取溶剂浓度100%、75%、50%、25%甲醇、水对川木香中木香烃内酯、紫丁香苷和去氢木香内酯的提取效果。结果如图1B所示，以甲醇作为提取溶剂时，3种目标化合物的总峰面积最高且具有显著性，故选择100%甲醇作为提取溶剂。

2.3.3 微波提取功率的考察 微波提取操作同上，保持其他因素一致，考察微波功率200、400、600、800、1 000、1 200 W对提取川木香中3种目标成分的影响。结果如图1C所示，当微波以400 W功率进行提取时，紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯的总峰面积最高，因此微波提取功率设定为400 W。

2.3.4 提取时间的考察 考察提取0、2、5、10、15、20 min时，微波提取紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯的提取效果。结果如图1D所示，微波提取川木香 2、5、10、15 min 时，3 种目标化合物的总峰面积没有显著性差异，为降低能耗，所以微波提取时间定为2 min。

2.3.5 液料比的考察 按照液料比200∶1、100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1（mL/g）分别加入提取溶剂甲醇20、10、8、6、4、2 mL，对川木香进行微波提取，计算紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯的提取率。结果如图 1E 所示，液料比为 100∶1（mL/g）和 80∶1（mL/g）时，木香烃内酯、紫丁香苷和去氢木香内酯的总提取率高于其余液料比下3种目标化合物的总提取率，故为减少有机溶剂消耗，料液比选择80∶1（mL/g）。

图1 微波提取川木香各因素的优化结果Fig.1 Optimization of microwave extraction factors of vladimiriae radix

2.3.6 方法比较 随机选取6批川木香样品分别进行微波提取和超声提取，UPLC分析测定。其中超声提取法来源于2020年版《中国药典》[25]，精密称取川木香粉末50 mg，加入甲醇4 mL，密封放置过夜，超声30 min（180 W/40 kHZ），放凉至室温后测定分析。结果如图2所示，微波提取的3种指标成分的溶出率均高于超声提取，且微波提取法所用时间更短，效率更高，所以微波提取川木香优于传统的超声提取。

图2 川木香微波提取与超声提取对比图Fig.2 Comparison of microwave extraction and ultrasonic extraction of vladimiriae radix

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、检测限及定量限 取混合对照品溶液，用甲醇稀释成一系列浓度，用UPLC测定各色谱峰峰面积。以对照品溶液浓度（μg/mL）为横坐标X，色谱峰峰面积为Y，制作标准曲线。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别定义为信噪比（S/N）为3和10时的化合物浓度。紫丁香苷，木香烃内酯，去氢木香内酯的回归方程分别为：Y=26944X+2322.1 （r2=0.9999），Y=13 653X+13 665（r2=0.999 9），Y=8 188.3X+14 581（r2=0.999 9），线性范围分别为 0.937 5～60 μg/mL，6.25 ～400 μg/mL，11.25 ～720 μg/mL，LOD 分 别 为0.050 μg/mL，0.215 μg/mL，0.190 μg/mL，LOQ 分 别为 0.200 μg/mL，0.860 μg/mL，0.760 μg/mL。

2.4.2 精密度实验 取配制的60 μg/mL紫丁香苷，400 μg/mL 木香烃内酯，720 μg/mL 去氢木香内酯混合对照品溶液作为高浓度混合标准品溶液，用甲醇进行稀释制备中浓度、低浓度的混合标准品溶液。每种浓度的混合标准品溶液连续进样6针，分别计算各浓度下3种目标化合物准确度的RSD值作为日内精密度的表征。连续重复3 d，分别计算3种化合物3 d间准确度的RSD值作为日间精密度的表征。结果如表1所示，该方法下紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯高、中、低浓度的日内和日间精密度RSD均小于3%，表明该方法精密度良好。

表1 3种目标化合物的日内日间精密度、24 h稳定性及其准确度（n=6）Tab.1 Intra-day and inter-day precision and 24 h stability and accuracy of three target compounds(n=6)

2.4.3 重复性实验 精密称取川木香粉末6份，每份50 mg，采用优化的微波提取法平行制备供试品溶液，UPLC进样分析。记录紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯的峰面积，并利用标准曲线计算其含量，用其含量的RSD值作为重复性的表征。结果：紫丁香苷、木香烃内酯、去氢木香内酯含量的RSD值分别为 2.65%、2.71%、2.45%，均小于 3%，表明所建立方法重现性良好。

2.4.4 稳定性实验 取混合标准品溶液（高、中、低浓度）分别在 0、2、4、6、8、12、24 h 定时进样分析，计算3种目标化合物准确度的RSD值。结果如表1所示，紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯高中低浓度的稳定性RSD值介于范围1.47%～2.45%，表明川木香样品溶液中的3个目标成分在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率实验 精密称取川木香样品粉末6份，每份25 mg，置于微波内衬管中，加入定量的紫丁香苷，木香烃内酯和去氢木香内酯（加入的对照品量为25 mg药材中含有的3种成分的量），用甲醇补足提取溶液体积至4 mL，摇匀，采用微波提取法平行制备样品溶液，并进行UPLC分析测定，计算回收率。紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯的平均回收率分别为 101.79%，101.91%，102.23%，平均回收率 RSD 分别为 1.73%，1.28%，0.89%，平均回收率介于范围 101.79%～102.23%，且 RSD＜3%，表明该方法加样回收率结果良好，方法准确可靠。

2.5 含量测定 取收集的22批川木香药材，精密称取粉末50 mg，进行微波提取，并通过UPLC分析测定，每个样品重复3次。色谱图如图3所示，紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯分离度良好。3种成分的含量测定结果见表2。

表2 川木香样品中3种成分含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.2 Determination results of the content of three components in vladimiriae radix samples(mg/g，n=3)

图3 超高效液相色谱图Fig.3 UPLC chromatogram

3 讨论

微波提取法是基于提取物质细胞内的水等极性分子吸收微波后，两个偶极在外部电场的作用下震荡释能，从而产生大量迅速剧烈的分子间超高速运动，摩擦碰撞产生了热能，致使细胞内的温度迅速升高，内部压力也随之增大，冲破细胞膜和细胞壁，促进细胞内成分的流出。这是一种由内而外的加热，具有溶剂用量少、所需温度低、提取效率高、提取时间短、节能环保等优点，目前广泛应用于天然产物有效成分的提取[26-27]。本研究采用微波法提取川木香中的紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯，提取时间仅需要2 min，与文献报道的回流提取法和超声提取法比[19，28]，大大缩短了提取时间，提高了提取效率。另外，在检测方法上，本实验采用UPLC梯度洗脱，UPLC法相比于HPLC法分析时间更短，梯度洗脱使川木香中的各成分峰分离度良好，既满足了3种目标成分定量的要求，又为后续建立川木香的指纹图谱，开展其谱效学研究提供了较好的分析方法。

本研究首次采用微波提取结合UPLC分析测定了22批川木香中紫丁香苷，木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，含量测定结果表明市场上的川木香中3种化学成分的含量存在较大差异，因此为保证临床用药药效的专一性，有必要进一步加强川木香药材的质量控制，而本实验建立的提取分析方法稳定可靠，高效快速，为此提供了技术支持。