富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶的发酵工艺研究

周艳华，李 涛 *，黄小波，刘 颖，陈嘉正

（1.长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410111）

纳豆（natto）是由大豆接种纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）发酵而成的一种具有悠久历史的豆制品，起源于中国，盛行于日本[1]。纳豆富含纳豆激酶（nattokinase，NK），其具有多种生理功能，如抗血栓[2]、抗高血压[3]、抗凝血[4]、抗动脉粥样硬化[5]、降低胆固醇等[6-7]。随着我国人口老龄化日益严重，老年病如高血压、高血脂、高血糖等发病率越来越高，据世界卫生组织（world health organization，WHO）数据显示，全世界每年死于心脑血管疾病的人数约占全世界死亡总人数的1/3，我国心脑血管疾病死亡人数最高[8]。

纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，纳豆虽富含NK，具保健功能，但因其强烈的“氨臭味”一直未被国人所接受[9]。因此改良纳豆风味，消除掩盖其“氨臭味”，提高消费者的接受度尤为重要。目前，改良纳豆风味的方法主要有优化发酵菌种、添加发酵底物和添加辅料等[10]。随着“健康中国2030”国民营养计划的开启，消费者的营养健康意识不断增强，具有功能性的酸奶的研究开发逐渐成为热点[11]，目前关于纳豆酸奶的研究报道甚少，仅见于个别专利中[12]，因此开发具有一定保健功能的纳豆酸奶具有重要的意义。

抹茶是采用覆盖栽培的茶树鲜叶经蒸汽（或热风）杀青后、干燥制成的叶片为原料，经研磨工艺加工而成的微粉状茶产品，抹茶粉因清新爽口的茶香味可起到掩蔽剂的作用[13]。因此，本研究采用添加辅料抹茶粉和通过乳酸菌发酵的方式消除掩盖纳豆的“氨臭味”，以纳豆豆浆和复原乳为主要原料，制备富含NK抹茶纳豆酸奶，分别采用单因素试验及正交试验优化其发酵工艺，并从感官、理化、微生物指标方面对成品进行品质评价。以期为富含NK功能食品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

大豆、抹茶粉、白砂糖、全脂奶粉（蛋白质含量22.0g/100g、脂肪26.0 g/100 g、碳水化合物45.5 g/100 g）：市售；乳酸菌发酵剂（保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）二者比例为1∶1）：北京川秀有限公司；纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilisnatto）（BNCC 185324）：北纳创联生物技术有限公司。

1.1.2 培养基

营养肉汁培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.0。121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

SPX-250B-Z恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；EFG4H恒温振荡器：常州智博瑞仪器制造有限公司；SLS-60高压均质机：上海申鹿均质机有限公司；SWCJ-IFD洁净工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；YXQ-LS-I8SI不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DJ13B-D08型家用豆浆机：九阳股份有限公司；UV-5100紫外分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；AL104-01电子分析天平、PHS-3C精密酸度计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KPB-V1358搅拌机：深圳市康佳电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 富含NK抹茶纳豆酸奶加工工艺流程及操作要点

操作要点：

纳豆芽孢杆菌发酵剂的制备：将200 μL 纳豆芽孢杆菌发酵剂冻干粉倒入10 mL营养肉汁培养基试管中，置于30 ℃复活、增殖24 h，即为后期所用的发酵剂。

纳豆豆浆的制备：筛选颗粒饱满的大豆100 g，清洗后置于800 mL纯净水中25 ℃浸泡12 h，去皮沥干，按豆水比1∶9（g∶mL）加入豆浆机中磨浆，经80目滤网过滤得豆浆[14]。将豆浆煮沸，经冷却后按1%的接种量接种纳豆芽孢杆菌，并于37 ℃有氧发酵24 h，即得纳豆豆浆。

复原乳的制备：将全脂乳粉与蒸馏水在50 ℃条件下按照料液比1∶6（g∶mL）混合，加入6%～8%白砂糖，不断搅拌至完全溶解。混合乳液在温度50 ℃、10～20.0 MPa条件下均质10 min，在90 ℃条件下灭菌10～15 min，立刻冷却至42 ℃，即得复原乳。

纳豆乳液：将纳豆豆浆与复原乳按比例6%～8%混合均匀，即得纳豆乳液。

接种、发酵：无菌条件下，向纳豆乳液中按比例迅速接种乳酸菌0.2%～0.4%，抹茶粉0.5%～0.7%，搅拌均匀，置于42 ℃恒温培养箱中培养4～6 h，直至凝乳形成。

后熟：发酵完成后，置于4 ℃条件下冷藏后熟12 h，即得富含NK抹茶纳豆酸奶成品。

1.3.2 富含NK抹茶纳豆酸奶发酵工艺优化

单因素试验：在白糖添加量6%、抹茶粉添加量0.5%、乳酸菌接种量0.3%、发酵时间4 h的基本条件下，以感官评分为评价指标，考察纳豆豆浆添加量（2%、4%、6%、8%、10%）对富含NK抹茶纳豆酸奶感官品质的影响。在此基础上，依次考察白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、抹茶粉添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、乳酸菌接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、发酵时间（4 h、6 h、8 h，10 h、12 h）对富含NK抹茶纳豆酸奶感官品质的影响。

正交试验：在单因素试验的基础上，以感官评分为评价指标，选择对抹茶纳豆酸奶的评分有较大影响的4个因素纳豆豆浆添加量（A）、白砂糖添加量（B）、抹茶粉添加量（C）、乳酸菌接种量（D），采用正交试验设计优化富含NK抹茶纳豆酸奶发酵工艺。正交试验因素与水平见表1。

表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization

1.3.3 分析检测

纳豆激酶酶活的测定：参考改良的紫外分光光度法[15]；蛋白质的测定：参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[16]；脂肪的测定：参考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[17]；非脂乳固体的测定：参考GB 5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固体的测定》[18]；酸度的测定：参考GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》[19]：微生物指标检测：参考GB 4789.18—2016《食品微生物学检验乳与乳制品检验》[20]。

1.3.4 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行ANOVA单因素方差分析，并采用Duncan法检验数据的差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

1.3.5 富含NK抹茶纳豆酸奶感官评价

采用主观赋权法，选取20名专业品评员对富含NK抹茶纳豆酸奶进行感官评分（满分100分），并取其平均值[21]。感官指标评分标准见表2。

表2 富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶感官评定标准Table 2 Sensory evaluation standards of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 纳豆豆浆添加量的确定

纳豆豆浆添加量对富含NK抹茶纳豆酸奶感官评分的影响见图1。

图1 纳豆豆浆添加量对富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶感官品质的影响Fig.1 Effect of natto milk addition on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

由图1可知，纳豆豆浆添加量对感官评分有显著的影响（P＜0.05）。当纳豆豆浆添加量＜6%时，感官评分变化不大。当纳豆添加量过少时，酸奶拉丝现象不明显，保健功能不突出，因此在感官评分无显著差异的情况下，应尽可能选择高的纳豆豆浆添加量，以提高富含NK抹茶纳豆酸奶的功效；当纳豆豆浆添加量为6%时，感官评分最高，为76.8分；但当纳豆豆浆添加量＞6%时，感官评分有显著差异（P＜0.05），其感官评分急剧下降，这主要是由于随着纳豆豆浆添加量的增高，纳豆中的“氨臭味”也逐渐突出，适口性差，导致其感官评分逐渐下降。因此，选择最适纳豆豆浆添加量为6%。

2.1.2 白砂糖添加量的确定

白砂糖添加量对富含NK抹茶纳豆酸奶感官评分的影响见图2。由图2可知，白砂糖添加量对感官评分有显著的影响（P＜0.05），当白砂糖添加量＜8%时，其感官评分随着白糖添加量的增加而增高；当白砂糖添加量为8%时，其感官评分最高，为85.0分；当白砂糖添加量＞8%时，其感官评分随着白砂糖添加量的增加而逐渐趋于平缓。因此，考虑到生产成本等因素，选择最适白砂糖的添加量为8%。

图2 白砂糖添加量对富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶感官品质的影响Fig.2 Effect of sugar addition on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2.1.3 抹茶粉添加量对富含NK抹茶纳豆酸奶品质的影响

抹茶粉添加量对富含NK抹茶纳豆酸奶感官评分的影响见图3。

图3 抹茶粉添加量对富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶感官品质的影响Fig.3 Effect of matcha powder addition on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

由图3可知，抹茶粉添加量对感官评分有显著的影响（P＜0.05），抹茶粉添加量在0～0.7%范围内，随抹茶粉添加量的增加，其感官评分逐渐增高；抹茶粉添加量增加至0.7%，感官评分最高，为85.6分；当继续增加至0.9%时，感官评分稍有下降。添加抹茶粉不仅可赋予酸奶良好的风味，还增加了酸奶的营养价值，抹茶粉中的茶多酚为NK抹茶纳豆酸奶增加了抗氧化等功效，并具有一定的掩盖纳豆“氨臭味”的作用。抹茶粉添加量为0.5%～0.7%时，感官评分趋于平稳。因此，考虑到生产成本，选择最适抹茶粉的添加量为0.5%。

2.1.4 乳酸菌接种量的确定

乳酸菌接种量对富含NK抹茶纳豆酸奶的感官评分影响见图4。由图4可知，乳酸菌接种量对感官评分有显著的影响（P＜0.05），乳酸菌接种量在0.1～0.3%范围内增加时，感官评分变化呈上升趋势；当乳酸菌添加量为0.3%时，感官评分达到最大值，为84.9分，随着乳酸菌接种量的继续增加，感官评分逐渐下降。乳酸菌接种量过少时，酸奶发酵不完全，容易出现酸奶酸度不够，滋味不柔和，香气不协调，酸奶凝固性不好等问题；当乳酸菌接种量过高时，发酵过度，产酸过快、过多，导致酸甜不协调，滋味不柔和，感官评分降低。因此，选择最适的乳酸菌接种量为0.3%。

图4 乳酸菌接种量对富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶的感官品质的影响Fig.4 Effect of lactic acid bacteria inoculum on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2.1.5 发酵时间对富含NK抹茶纳豆酸奶品质的影响

发酵时间对富含NK抹茶纳豆酸奶感官评分的影响见图5。

图5 发酵时间对富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶感官品质的影响Fig.5 Effect of fermentation time on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

由图5可知，发酵时间对感官评分有显著的影响（P＜0.05），随着发酵时间在4～12 h范围内的延长，其感官评分变化呈明显上升趋势。但当发酵时间超过6 h，其感官评分变化随着发酵时间的延长而逐渐趋于平缓，此时，乳酸菌基本发酵完全，对酸奶的影响不大。而当发酵时间低于6 h时，因乳酸菌发酵不完全，酸奶没有完全凝固，滋味不柔和，酸甜不协调。因此，考虑到生产成本等综合因素，选择最适的发酵时间为6 h。

2.2 富含NK抹茶纳豆酸奶发酵工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，以感官评分为评价指标，选择纳豆豆浆添加量（A）、白砂糖添加量（B）、抹茶粉添加量（C）、乳酸菌接种量（D）为影响因素，采用正交试验设计优化富含NK抹茶纳豆酸奶发酵工艺，正交试验结果与分析见表3。

表3 发酵工艺优化正交试验结果及分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization

由表3可知，影响富含NK抹茶纳豆酸奶感官评分的因素大小依次为：乳酸菌接种量＞抹茶粉添加量＞纳豆豆浆添加量＞白砂糖添加量，最优发酵工艺方案为A2B2C3D2，即纳豆豆浆添加量6%，白砂糖添加量8%，抹茶粉添加量0.7%，乳酸菌添加量0.3%。在此优化条件下进行3次平行验证试验，其感官评分为88.6分。

2.3 富含NK抹茶纳豆酸奶的品质

2.3.1 感官指标

富含NK抹茶纳豆酸奶的感官指标见表4。由表4可知，采用上述优化后的工艺生产的富含NK抹茶纳豆酸奶的感官指标符合GB 19302—2010《发酵乳》[22]中风味发酵乳感官要求。产品感官评价良好的原因可能是由于以下几个方面，纳豆芽孢杆菌与乳酸菌嗜热链球菌共同发酵可以改良纳豆风味[23]。抹茶所具有的浓厚的茶香味能起到良好的掩盖其他异味的作用[24]；添加白砂糖发酵酸奶，经后熟过程可改良纳豆的风味[25]。

表4 富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶的感官评价指标Table 4 Sensory evaluation indexes of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2.3.2 理化指标

富含NK抹茶纳豆酸奶的理化指标见表5。由表5可知，采用上述优化后的工艺生产的富含NK抹茶纳豆酸奶的理化指标均符合GB 19302—2010《发酵乳》[22]中理化指标要求。此外，采用此法制备的富含NK抹茶纳豆酸奶的NK活性为688.6 U/mL，具有较强的保健功能。

表5 富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶的理化指标Table 5 Physicochemical indexes of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2.3.3 微生物指标

富含NK抹茶纳豆酸奶的微生物指标见表6。由表6可知，采用上述优化后的工艺生产的富含NK抹茶纳豆酸奶的微生物指标符合GB 19302—2010《发酵乳》[22]中微生物指标的规定要求。

表6 富含纳豆激酶抹茶纳豆酸奶的微生物指标Table 6 Microbiological indexes of matcha natto yogurt rich in nattokinase

3 结论

该研究以富含NK的纳豆豆浆和复原乳为主要原料，制备富含NK的抹茶纳豆酸奶。通过单因素和正交试验得到的富含NK抹茶纳豆酸奶的最适发酵工艺条件为：纳豆豆浆添加量6%，白砂糖添加量8%，抹茶粉添加量0.7%，乳酸菌添加量0.3%。在此条件下，酸奶的感官评分为88.6分，具有良好的口感，滋味纯正，香气协调，质地顺滑，有拉丝。酸度、脂肪、蛋白质、非脂乳固体含量分别为82°T、3.15 g/100 g、3.08 g/100 g、8.25 g/100 g，NK活性为688.6 U/mL。乳酸菌数为5.8×108CFU/mL，各指标均符合国标GB 19302—2010《发酵乳》要求。该产品并具有溶血栓、降血压、降血脂等多种功效，具有广阔的开发前景。