紫斑牡丹花粉破壁工艺优化及其金属元素测定

王新娣，石晓峰*，李 运，沈 薇，刘东彦，范 彬，马趣环

(1.甘肃省医学科学研究院，甘肃兰州 730050；2.兰州市食品药品检验检测研究院，甘肃兰州 730030)

紫斑牡丹(Paeoniarockii)是毛茛科芍药属多年生木本植物，因花瓣基部有一个明显的紫斑而得名[1]，其主要分布于四川北部、甘肃南部、陕西秦岭中段以西，是我国中西部地区的特有中药材和花中珍品[2]。紫斑牡丹花粉中富含有多种营养素、维生素和矿物质，还含有大量天然活性物质，如黄酮类化合物、酶、激素、核酸和有机酸等[3]，由于花粉壁具有异常耐酸耐碱耐腐蚀的坚硬外壁，阻碍了人体对花粉活性成分消化吸收，同时也阻止了花粉的高值化利用。因此，研究紫斑牡丹花粉破壁工艺对紫斑牡丹花粉综合利用开发具有重要的意义。

目前花粉的破壁方法主要有生物法、化学法、物理法和复合法。曹红刚等[4]用酵母、灵芝、杏鲍菇、羊肚菌4种真菌发酵油菜蜂花粉，其破壁率为 66.53%～79.10%。林瑾等[5]采用NaOH和H2O2预处理玫瑰蜂花粉，使其外壁破坏，再使用纤维素酶、黄瓜提取液和稀盐酸溶液处理玫瑰蜂花粉，其破壁率达到99%。余勃[6]应用微粉碎对茶花粉进行破壁处理，花粉破壁率达100%。何余堂等[7]采用温差法、超声波法、酶法和混合法4种方法对玉米花粉进行破壁处理，其破壁率分别为超声波法31.2%、温差法46.3%、酶法80.4%、混合法98.6%。上述诸多花粉破壁的方法各有优缺点，有的方法设备成本投资较大，花粉破壁率高；有的方法成本低，花粉破壁率也低；有的方法引入其他化学溶剂，使样品污染的可能性增大；有些方法处理周期长，导致花粉容易变质。在诸多的花粉破壁方法中，究竟哪一种更适合紫斑牡丹花粉，且营养成分损失小，破壁率高，还需要进行更多的试验验证。因此，该研究选投资成本低的温差破壁法，响应面试验优化牡丹花粉温差破壁工艺，以破壁率为评价指标对紫斑牡丹花粉进行破壁，并测定和分析牡丹花粉中金属含量变化，为紫斑牡丹花粉的综合利用和开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂紫斑牡丹花粉，兰州新区中川牡丹园提供，储存于冰箱-18 ℃；99.99%氩气，上海通辉特种气体有限公司；99.99% 氦气，上海通辉特种气体有限公司；Mn、Zn、Pb、Cr、Cd、As 标准储备液，美国安捷伦科技股份有限公司;浓硝酸，色谱纯，德国默克化工技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备MDF-C2156VAN低温冷冻存储箱，日本三洋公司； BCD-237HF可变温冰箱，青岛Haier 集团；DW-86L626超低温保存箱，青岛Haier 集团；BH-2日本电子显微镜，OLYMPUS公司；AE260万分之一电子天平，瑞士Mettle Toledo 公司；PT-10 pH计，德国Sartorius公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌浴，郑州长城科工贸有限公司；Agilent 7900型电感耦合等离子体质谱仪，美国安捷伦科技股份有限公司；UltraCLAVELV微波消解仪，意大利麦尔斯通有限公司；Milli-Q IQ7000超纯水系统，密理博中国有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1牡丹花粉的预处理。将牡丹花粉均匀铺在白色瓷盘上面，厚度不超过0.5 cm，盖上一块白布，低温烘干，直至花粉中水分降至5%以下，过7号筛除杂，得到精选的牡丹花粉。

1.3.2破壁率的测定。分别精密称取未经破壁处理花粉和破壁后花粉适量，制成相同浓度的混悬液，吸取相同体积混悬液，制片，在400倍电子显微镜下进行镜检，以未破壁花粉为对照。每个样品重复制片3张，每片5个视野，观察视野内的细胞破碎情况，求平均值。根据公式破壁率=(1-A/B)×100%计算破壁率，式中，A为视野中未破壁的细胞数；B为视野中细胞总数。

1.3.3温差破壁法的工艺优选。将精选的紫斑牡丹花粉按温差破壁工艺流程(紫斑牡丹花粉—低温冷冻—高温解冻—离心收集—低温干燥—破壁花粉)进行操作，按“1.3.2”方法测定花粉破壁率，采用单因素和响应面试验优选其破壁工艺。

1.3.4单因素试验。以破壁率为指标，采用控制变量法考察冷冻温度、液料比、冷冻时间、解冻时间、解冻温度对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。

1.3.5响应面优化试验。以单因素试验数据为基础，以液料比、解冻时间、解冻温度为响应变量，破壁率为响应值，利用DesignExpert 8.0.6软件进行4因素3水平响应面试验优化花粉破壁工艺，试验因素与水平设计见表1。

1.3.6紫斑牡丹花粉中金属元素的测定。

1.3.6.1供试品溶液的制备。 取花粉样品于60 ℃干燥4 h，取约0.3 g，精密称定，置于微波消解罐中，加65%硝酸3.0 mL、超纯水1.0 mL，按表2程序进行消解。冷却后取出消解管，将消化液转移至50 mL容量瓶中，用少量超纯水洗涤消解管3次，合并洗涤液至容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，作为供试品原液，备用[8-9]。同时同法制备空白对照及标准参考物质。

表1 响应面试验因素和水平Table 1 Element and levels of RSM test

表2 微波消解程序Table 2 Procedures of microwave digestion

1.3.6.2仪器条件。采用氦气碰撞反应池模式，用调谐液对仪器质量轴、分辨率、灵敏度、双电荷、氧化物进行优化。氩气为载气，氦气为碰撞气体，等离子体气流速15.0 L/min，载气流速1.17 L/min，雾化器为Barbinton，石英双通道雾化室，射频功率1 300 W，雾化室温度2 ℃，碰撞模式为氦气流量5.0 mL/min，蠕动泵转数为30 r/min，采样深度8.0 mm，测点数3，分析时间0.1 s，重复次数3，全定量分析模式。

1.3.6.3样品的含量测定。紫斑牡丹花粉破壁前后10种金属元素的测定按“1.3.6.1”和“1.3.6.2”方法，采用内标法进行定量测定，每个样品平行测定3次，计算各元素的平均含量。

2 结果与分析

2.1 紫斑牡丹花粉破壁前后的显微特征观察未破壁紫斑牡丹花粉和破壁紫斑牡丹花粉分别置400倍电子显微镜下观察，发现破壁前花粉绝大多数为单花粉，少数为复合花粉，均被一层完整的膜包裹；破壁的花粉其包裹的膜层完全破裂、内容物散在(图1)。

图1 紫斑牡丹花粉破壁前(a)、后(b)的显微结构Fig.1 Microstructure of Paeonia rockii pollen before (a) and after (b) wall-breaking

2.2 单因素试验

2.2.1冷冻温度对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。称取精选牡丹花粉适量，4份，分别装入塑料容器中，加盖密封，置于冷冻装置中分别于-10、-20、-75、-150 ℃冷冻24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，摇匀，置50 ℃水浴中中速搅拌6 h，得到花粉混合溶液；然后在高速离心机中离心10 min，所获固体物质于15～25 ℃的条件下干燥，即得到破壁牡丹花粉成品，测定其破壁率，结果见图2。由图2可知，随着冷冻温度降低，破壁率在提高，当冷冻温度为-150 ℃时，破壁率达到了最高值，由此确定冷冻温度为-150 ℃，亦即温差为245 ℃。

图2 冷冻温度对紫斑牡丹花粉破壁率的影响Fig.2 Effect of freezing temperature on wall-broken rate of Paeonia rocki pollen

2.2.2液料比对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。称取精选牡丹花粉适量，6份，分别装入塑料容器中，加盖密封，置于冷冻装置中于-150 ℃冷冻24 h，取出，迅速加入不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)的95 ℃沸水，其他步骤同“2.2.1”方法操作，结果见图3。由图3可知，随着液料比的增加破壁率不断增加，当液料比为20∶1时，破壁率达到最大，之后随液料比增加破壁率下降，究其原因可能是水量的多少会影响搅拌的力度。由此将液料比定为15∶1～25∶1。

图3 液料比对紫斑牡丹花粉破壁率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.2.3冷冻时间对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。称取精选牡丹花粉适量，5份，分别装入塑料容器中，加盖密封，置于冷冻装置中于-150 ℃冷冻不同时间(12、24、48、72、96 h)，取出，迅速加入20∶1的95 ℃沸水，其他步骤同“2.2.1”方法操作，结果见图4。由图4可知，冷冻12～24 h时，破壁率有较为明显的上升趋势，冷冻超过24 h后对破壁率影响不大，考虑到时间和效率的问题，将冷冻时间固定为24 h。

图4 冷冻时间对紫斑牡丹花粉破壁率的影响Fig.4 Effect of freezing time on wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.2.4解冻时间对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。称取精选牡丹花粉适量，5份，分别装入塑料容器中，加盖密封，置于冷冻装置中于-150 ℃冷冻24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，摇匀，置50 ℃水浴中中速搅拌，分别解冻2、4、6、8、10 h，其他步骤同“2.2.1”方法操作，结果见图5。由图5可知，破壁率随着解冻时间的延长而增加，当超过6 h时破壁率基本呈平缓趋势，故将解冻时间固定为6 h左右。

图5 解冻时间对紫斑牡丹花粉破壁率的影响Fig.5 Effect of defreeze time on the wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.2.5解冻温度对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。称取精选牡丹花粉适量，5份，分别装入塑料容器中，加盖密封，置于冷冻装置中于-150 ℃冷冻24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，摇匀，分别置不同温度(18、28、38、48、58 ℃)水浴中中速搅拌，分别解冻6 h，其他步骤同“2.2.1”方法操作，结果见图6。由图6可知，解冻时温度在18～28 ℃，花粉的破壁率较大，当温度大于28 ℃时花粉破壁率呈明显下降趋势，而18～28 ℃基本是室温水平，故从降低耗能的角度考虑，解冻温度控制在18～28 ℃最佳。

图6 解冻温度对紫斑牡丹花粉破壁率的影响Fig.6 Effect of defreeze temperature on the wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.3 响应面优化试验

2.3.1试验设计及结果。由单因素试验筛选出的最佳温差破壁工艺条件为冷冻温度-150 ℃、冷冻时间24 h、液料比15∶1～25∶1、解冻时间6 h左右、解冻温度18～28 ℃。固定冷冻温度和冷冻时间，选择影响温差破壁工艺的因素液料比、解冻时间、解冻温度，以花粉的破壁率(Y)为响应值，根据Box-benhnken试验设计原理，设计3因素3水平试验，然后按表1设计进行试验，结果见表3。

表3 Box-Behnken 试验设计及试验结果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

2.3.2模型的建立及显著性检验。利用 DesignExpert 8.0.6软件对表3数据进行回归分析，得到花粉的破壁率(Y)对液料比(A)、解冻时间(B)、解冻温度(C)的二元多项回归模型为Y=-159.307 08+13.209 8A+41.111 863B-1.445 40C-0.099 5AB+0.013 3AC+0.076 6BC-0.331 03A2-2.915 81B2+3.067 5C2。通过对回归模型进行方差分析(表4)，可以看出模型的F=43.74(P< 0.000 1)，模型方程具有极显著性；失拟项P=0.056 0，说明未知因素对试验结果影响不显著；回归决定系数(R2)为0.982 5，说明 98.25%的响应值变化来源于所选因素；修正回归决定系数(Radi)为0.960 1，说明该模型能解释 96.01%的响应值变化；预测值与试验值具有高度相关性，说明该回归方程对试验拟合度较好，试验结果可靠。由回归方程和方差分析还可看出，一次项中B、C对破壁率具有极显著影响，A对破壁率影响不显著，交互项中AB、BC、AC对破壁率影响不显著；二次项中A2、B2对破壁率有极显著影响，而C2对破壁率影响不显著，说明所得回归方程能够很好地预测花粉破壁率随各响应因子的变化而变化。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variances

2.3.3响应面分析。依回归模型作出各因素对花粉破壁率影响的响应面图，考察响应面的形状，分析温差破壁各因素对花粉破壁率的影响，结果见图7。

交互作用的大小可由等高线的形状来反映，若呈椭圆形，说明两因素的交互作用显著，若呈圆形则相反，而响应面曲线较陡也说明两因素交互作用显著。由图7可知，BC有一定的交互作用。

2.3.4最佳破壁工艺条件的确定和验证试验。通过DesignExpert 8.0.6软件对回归方程进行求解，得到牡丹花粉温差破壁的最佳工艺条件:冷冻温度-150 ℃、冷冻时间24 h、液料比19.27∶1、解冻时间6.96 h、解冻温度20 ℃，其理论破壁率为93.11%。考虑到实际操作的简便性和可操作性，调整工艺条件为冷冻温度-150 ℃、冷冻时间24 h、液料比20∶1、解冻时间7 h、解冻温度20 ℃。在此最优破壁条件下进行3次平行验证试验，得到牡丹花粉的平均破壁率为 92.82%，与理论值间误差较小，说明利用响应面优化得到的条件准确、可行。

2.4 紫斑牡丹花粉样品中金属元素测定取紫斑牡丹花粉按“1.3.6.1”方法制备供试品溶液, 依法测定，计算出供试品溶液质量浓度，即得各元素的具体含量，结果见表5。从表5可以看出，紫斑牡丹花粉中金属元素 Zn、Mg、 K、 Ca、Mn、 Fe、 Sr含量较高，参考《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》及《中华人民共和国药典》中对中药材(饮片)中重金属及砷盐限量指标(Pb≤5.0 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、As≤2.0 mg/kg)，紫斑牡丹花粉中有毒金属元素Pb、Cd、As含量低于检出限。

3 讨论与结论

花粉的细胞壁由内壁和外壁组成，外壁主要成分是孢粉素，是一种高分子氧化聚合物，使得花粉外壁非常坚硬，即使人体在消化过程中未能完全破坏外壁。花粉破壁不可避免地破坏了其营养成分，特别是酶类物质，而且花粉破壁后不易保存[10]。紫斑牡丹花粉是否应该破壁将在后续的试验中求证。

图7 液料比、解冻时间、解冻温度对花粉破壁率的等高线和响应面Fig.7 Contour line and surface plot of liquid-solid ratio,defreeze time and defreeze temperature on the wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

表5 紫斑牡丹花粉破壁前后10种金属元素的含量比较(n=3)

该试验以牡丹花粉破壁率为指标，采用单因素试验对影响温差破壁的因素(冷冻温度、冷冻时间、液料比、解冻时间、解冻温度)进行了遴选，在此基础上通过固定冷冻温度和冷冻时间，选择影响温差破壁工艺的因素(液料比、解冻时间、解冻温度)，根据Box-benhnken试验设计原理，优化得到牡丹花粉温差破壁的最佳工艺，即精选牡丹花粉装入塑料容器中，加盖密封，置于冷冻装置中于-150 ℃冷冻24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，摇匀，置20 ℃水浴中中速搅拌7 h，得到花粉混合溶液；然后在高速离心机中离心10 min，所获固体物质于15～25 ℃的条件下干燥，即得到破壁牡丹花粉成品，经验证该工艺的平均破壁率为 92.82%，说明工艺合理可行。

该试验利用ICP-MS法对产自甘肃兰州的紫斑牡丹花粉中10种元素进行了定量分析，结果显示，紫斑牡丹花粉中宏量元素K、Mg、Ca的含量分别为13 649.5、2 441.3、743.7 μg/g；其他微量金属元素中含量较高的为Zn、Fe、Mn，其含量分别为114.29、73.34、66.79 μg/g；紫斑牡丹花粉中有毒金属元素Pb、Cd、As含量低于检出限，符合行业标准及药典的要求。故紫斑牡丹花粉是一种无污染天然的保健食品。

通过对紫斑牡丹花粉破壁前后金属元素的对比分析，发现固体颗粒中的Mn、Zn、Sr、Fe、K、Mg、Ca等金属元素的含量均有所下降，这可能是紫斑牡丹花粉破壁后有大量的金属元素从细胞壁内释放出来，一部分溶解于溶液中，从而造成破壁后固体颗粒中金属元素含量减少，破壁后有利于微量元素和营养物质的释放。