褪黑素引发处理提高朝天椒种子萌发及幼苗耐盐性的生理机制

魏茜雅， 林欣琪， 梁腊梅， 秦中维， 李映志

(广东海洋大学滨海农学院，广东湛江524088)

辣椒(CapsicumannuumL.)起源于南美洲，是一年生或有限多年生蔬菜作物，属浅根系植物，根系吸水能力较弱[1]。中国各地均有种植。近年来中国辣椒种植面积稳定在2.10×106hm2以上，农业产值高达2.5×1011元，已成为中国种植面积最大、消费量最大、加工方式最多的蔬菜[2]。但近年来，在对山东、辽宁、江苏、四川的实地调查中发现，温室大棚栽培条件下，土壤表面均有大面积白色盐霜出现，有的甚至出现块状紫红色胶状物，土壤盐化板结，作物长势差，甚至绝产，其中以山东、江苏两省设施栽培的土壤盐渍化程度最为严重[3]。因此，生产上对耐盐辣椒品种或耐盐栽培措施的需求十分迫切。

近年来，种子引发技术在很多农作物和园艺作物中得到广泛研究和应用，该技术不仅可以提高种子的萌发速度，还能提高幼苗对干旱、重金属离子和盐胁迫等的抗逆性[4]。在辣椒种子引发处理上，吴凌云等[5]通过蛭石和硝酸钾(KNO3)对辣椒种子进行引发，发现蛭石和KNO3引发都可以提高辣椒种子的萌发和幼苗生长；白占兵等[6]发现，适量的赤霉素(GA3)可以促进辣椒种子萌发和幼苗生长；Ahmed等发现水杨酸能有效缓解盐胁迫对甜椒生理和形态特征的抑制作用[7]。

褪黑素(Melatonin，MT)为色氨酸吲哚类衍生物，具有很强的抗氧化作用，能促进植物侧根的生长并延缓叶片衰老[8-9]。褪黑素也被用于农作物的种子引发处理，如减轻干旱胁迫对生菜幼苗生长的影响[10]；促进老化燕麦种子的萌发[11]；提高紫花苜蓿的耐盐能力[12]；降低盐分胁迫对棉花种子的影响[13]等。然而，使用褪黑素对辣椒种子进行引发处理的研究还鲜见报道。

本试验利用不同浓度的褪黑素对朝天椒种子进行引发处理，分析其对盐胁迫下朝天椒种子萌发和幼苗生长的影响及引发后种子和幼苗生理指标变化，探究褪黑素引发处理的作用机制。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试验设计

供试朝天椒品种为茂蔬360。

将均匀饱满的朝天椒种子分别浸在浓度为0 μmol/L(T0)、1 μmol/L(T1)、5 μmol/L(T5)、25 μmol/L(T25)、50 μmol/L(T50)、75 μmol/L(T75)、100 μmol/L(T100)、125 μmol/L(T125)、150 μmol/L(T150)和200 μmol/L(T200)的10 ml褪黑素溶液中，在室温、黑暗条件下引发12 h，随后滤出种子，用蒸馏水冲洗干净，于25 ℃的暗室中自然风干至原始含水量。以未引发处理的种子为对照(CK)，取上述不同浓度褪黑素引发处理和CK的朝天椒种子各1～2 g，分3次重复，进行种子生理指标的测定。

将三层滤纸无褶皱的铺垫在玻璃培养皿中，并用100 mmol/L 盐液(NaCl溶液)完全浸湿滤纸。取经不同浓度褪黑素引发处理后的朝天椒种子和未引发处理的朝天椒种子，间距均匀摆放在培养皿中，每皿放置60粒种子，每处理3次重复。于温度为25 ℃的恒温培养箱中培养，每天补充处理液，保证滤纸湿润。以胚根长到与种子等长及以上，且胚芽长到种子长度一半以上为发芽标准[14]。每天记录发芽种子数，第12 d结束萌发试验。萌发结束后每个处理取中等长势的幼苗3株，测量胚根、胚芽长度。

用蒸馏水将盐液(100 mmol/L)胁迫下发芽的种子冲洗干净，挑选每个处理中萌发的种子播至含NaCl(100 mmol/L)的基质中，置于人工气候箱内生长。人工气候箱设置温度为25 ℃，光照周期为12 h光照/12 h黑暗, 光照度为7 600 lx，相对湿度为60%。每2 d浇灌一次盐液(100 mmol/L NaCl)，处理7 d后，将朝天椒幼苗的根系用去离子水清洗干净后吸干表面水分，取各处理中等长势的幼苗5株，重复3次，称得地上部鲜质量、根鲜质量及植株鲜质量(地上部鲜质量+根鲜质量)，测量株高、根长和植株全长(株高+根长)[15]。进一步将上述鲜样置于105 ℃烘箱中杀青15 min, 再在80 ℃下干燥至恒质量后，测定植株干质量(地上部干质量+根干质量)[16]。各处理称取鲜质量1～2 g幼苗叶片，重复3次，进行生理指标测定。

1.2 指标测定及萌发能力综合评价方法

1.2.1 种子萌发相关指标的算法 根据《国际种子检验规程》及相关文献计算下列指标[17-21]：

发芽势(GP)=种子发芽达日高峰时的累计发芽数/供试种子数×100%

发芽率(GR)=发芽结束后发芽种子数量/供试种子数×100%；

式中，i为发芽天数，Gi为第i天的发芽数。

活力指数=GI×S

式中，GI表示发芽指数；S为第12 d朝天椒幼苗根的长度。

1.2.2 种子萌发能力综合评价 用下式计算某一指标的隶属函数值：

Y=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Y表示该指标的隶属函数值，X表示该指标的测定值，Xmax和Xmin分别表示不同处理下该指标的最大值和最小值[15]。

进一步计算各指标的隶属函数值均值得到不同处理下种子萌发能力综合评价指标。

1.2.3 生理指标的测定方法 可溶性糖(SS)含量的测定采用蒽酮比色法[22]；丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸比色法[22]；抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性采用Nakano法测定[23]；可溶性蛋白(SP)含量采用考马斯亮蓝G-520法测定[22]；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[24]、脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮法测定[25]、过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法测定[26]、过氧化氢(H2O2)含量采用硫酸钛比色法测定[27]；超氧化物歧化酶(SOD)活性使用黄嘌呤氧化酶-NBT法测定[28]；超氧阴离子(O2·-)含量采用羟胺氧化法测定[29]；抗坏血酸(AsA)含量和脱氢抗坏血酸(DHA)含量测定采用分光光度法[30]。

1.3 数据处理

采用 Microsoft Excel 2019 软件和 SPSS 24.0软件进行统计分析和绘图。使用Duncan’s新复极差法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度褪黑素引发处理对盐胁迫下朝天椒种子萌发的影响

在100 mmol/L 盐胁迫下，不同浓度褪黑素引发处理后的朝天椒种子的萌发情况如图 1 所示。由图1可知，褪黑素溶液浓度低于100μmol/L时，随褪黑素引发浓度的增加，朝天椒种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数总体都呈增加趋势；但随着褪黑素浓度的进一步增加，各发芽指标都呈现减少趋势。与未引发处理的种子相比，100 μmol/L褪黑素溶液引发处理的朝天椒种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数分别增加了33.84%、120.27%、108.13%和312.71%，差异显著。这表明盐胁迫下，适宜浓度的褪黑素引发处理能显著增强朝天椒种子的萌发能力，本试验条件下最适的褪黑素引发浓度为100 μmol/L。

2.2 不同浓度褪黑素引发处理对盐胁迫下朝天椒幼苗植株全长、根长、鲜质量和干质量的影响

100 mmol/L盐胁迫下，不同浓度褪黑素引发处理后的朝天椒幼苗的植株全长、根长、株高和根长/株高比值情况如图 2 所示。由图2可知，褪黑素溶液浓度低于100μmol/L时，随褪黑素引发浓度的增加，朝天椒幼苗的植株全长、根长和株高总体都呈增加趋势；但随着褪黑素浓度的进一步增加，各指标都呈现减少趋势。与未引发处理相比，100 μmol/L褪黑素溶液引发处理的朝天椒幼苗植株全长、根长和株高分别增加了96.20%、96.48%和95.87%，差异显著；但根长/株高值在褪黑素浓度25 μmol/L 时为最大值，比未引发处理对照增加了38.21%，但差异不显著。

柱形图上不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200表示褪黑素引发处理浓度分别为0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L、125 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L的处理，CK为未引发处理对照。图1 不同浓度褪黑素引发处理对盐胁迫下朝天椒种子发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数的影响Fig.1 Effects of different melatonin-soaked concentrations on germination potential, germination percentage, germination index and vitality index of pepper under salt stress

柱形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图2 不同浓度褪黑素引发处理对盐胁迫下朝天椒幼苗植株全长、根长、株高和根长/株高比值的影响Fig.2 Effects of different melatonin-soaked concentrations on plant height(PH), root length(RL), PH+RL and RL/(PH+RL) of pepper seedlings under salt stress

100 mmol/L盐胁迫下，不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒植株鲜质量、根鲜质量、地上鲜质量和植株干质量的影响如图3所示。由图3可知，随着褪黑素引发液浓度的增加，植株鲜质量、根鲜质量、地上鲜质量和植株干质量呈抛物线变化趋势。褪黑素浓度为100 μmol/L 时，植株鲜质量、根鲜质量、地上鲜质量和植株干质量达到最大值，分别比未引发处理对照增加了48.61%、102.57%、52.99%和180.00%，差异显著。

柱形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图3 不同浓度褪黑素引发处理对盐胁迫下朝天椒植株鲜质量、根鲜质量、地上部分鲜质量和植株干质量的影响Fig.3 Effects of different melatonin-soaked concentrations on plant fresh weight, root fresh weight, shoot fresh weight and plant dry weight of pepper under salt stress

2.3 不同浓度褪黑素引发处理对盐胁迫下朝天椒种子萌发及幼苗生长效果的综合评价

采用隶属函数计算综合指标可以清晰判断不同浓度的褪黑素引发处理对朝天椒种子萌发及幼苗抗盐性的作用大小[31]。由表1可知，在盐胁迫下，隶属函数综合分析结果显示T100>T125>T75>T50>T150>T25>T5>T0>T1>T200>CK。T100处理的综合得分值最高，即褪黑素浓度为100 μmol/L时引发的效果最好。

表1 盐胁迫下不同浓度褪黑素引发处理后朝天椒各测定指标的隶属函数值

2.4 不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒种子生理的影响

2.4.1 不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒种子丙二醛和ROS含量的影响 如图4所示，不同浓度褪黑素引发处理后的朝天椒种子的丙二醛和过氧化氢含量随着褪黑素浓度的增加呈现先降低后上升的趋势，褪黑素浓度为100 μmol/L时，引发后种子的丙二醛和过氧化氢含量达最小值，分别比未引发处理对照降低了74.26%、67.16%，差异显著；引发处理后的朝天椒种子的超氧阴离子含量与未引发处理对照相比无显著性差异。

柱形图上不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图4 不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒种子MDA、过氧化氢和超氧阴离子含量的影响Fig.4 Effects of different melatonin-soaked concentrations on the contents of malondialdehyde (MDA), hydrogen peroxide and superoxide anion in pepper seeds

2.4.2 不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒种子可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)和脯氨酸(Pro)含量的影响 如图5所示，当褪黑素浓度低于100μmol/L时，随着褪黑素浓度的增加，朝天椒种子的SS、SP和Pro含量总体上呈增加趋势。浓度为100 μmol/L时，朝天椒种子的SS、SP和Pro含量达到最大值，分别比未引发处理对照增加51.88%、157.54%和28.72%，差异显著。但随着褪黑素浓度的进一步增加，朝天椒种子的SS、SP和Pro含量呈现下降趋势。

2.4.3 不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒种子POD和CAT活性的影响 如图6所示，不同浓度褪黑素引发处理后，随着引发液浓度的增加，朝天椒种子的POD和CAT活性呈抛物线变化趋势。褪黑素浓度为100 μmol/L时，引发处理后种子的POD和CAT活性为最大值，分别比未引发处理对照增加了185.57%和53.23%，差异显著。

2.4.4 不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒种子APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值的影响 如图7所示，不同浓度褪黑素引发处理后的朝天椒种子的APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值随着褪黑素浓度的增加总体上呈抛物线变化趋势，浓度为100 μmol/L时，引发处理后种子的APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值达最大值，分别比未引发处理种子增加了27.57%、1 377.00%、41.19%和880.37%，差异显著。

2.5 褪黑素种子引发处理对朝天椒盐胁迫下幼苗生理的影响

2.5.1 褪黑素种子引发处理对朝天椒盐胁迫下幼苗丙二醛和ROS含量的影响 如图8所示，在100 mmol/L盐胁迫下，经不同浓度褪黑素引发处理后幼苗丙二醛含量在75 μmol/L时含量达最小值，比未引发处理对照降低了37.54%，差异显著；过氧化氢和超氧阴离子含量在100 μmol/L时含量达最小值，分别比未引发处理对照降低了58.65%和42.00%，差异显著。

柱形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图5 不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒种子可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响Fig.5 Effects of different melatonin-soaked concentrations on soluble sugar, soluble protein and proline contents of pepper seeds

柱形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图6 不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒种子POD和CAT活性的影响Fig.6 Effects of different melatonin-soaked concentrations on peroxidase (POD) and catalase (CAT) activities of pepper seeds

柱形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图7 不同浓度褪黑素引发处理对朝天椒种子APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值的影响Fig.7 Effects of different melatonin-soaked concentrations on ascorbate peroxidase (APX) activity, ascorbic acid (AsA) content, dehydroascorbic acid (DHA) content and AsA/DHA value of pepper seeds

2.5.2 褪黑素种子引发处理对朝天椒盐胁迫下幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响 如图9所示，在100 mmol/L盐胁迫下，经不同浓度褪黑素引发处理后幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量随着褪黑素溶液浓度的增大呈先增大后下降的趋势，并在100 μmol/L时达到最大值，分别比未引发处理对照增加了38.89%、384.61%和37.46%，差异显著。

2.5.3 褪黑素种子引发处理对朝天椒盐胁迫下幼苗SOD、POD和CAT活性的影响 如图10所示，在100 mmol/L盐胁迫下，随着褪黑素溶液浓度的增大，经不同浓度褪黑素引发处理后的幼苗SOD、POD和CAT活性呈先增大后下降的趋势，SOD和POD活性在100 μmol/L达最大值，分别比未引发处理对照增加了240.24%和398.59%，差异显著；CAT活性在75 μmol/L达最大值，比未引发处理对照增加了275.60%，差异显著。

2.5.4 褪黑素种子引发处理对朝天椒盐胁迫下幼苗APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值的影响 如图11所示，在100 mmol/L盐胁迫下，褪黑素溶液浓度低于100μmol/L时，随褪黑素引发处理浓度的增加，朝天椒幼苗的APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值都呈增加趋势；但随着褪黑素浓度的进一步增加，各指标都呈现减少趋势。与未引发处理对照相比，100 μmol/L褪黑素溶液引发处理的朝天椒幼苗的APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值分别增加了106.89%、618.35%、134.26%和206.78%，差异显著。

柱形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图8 褪黑素种子引发处理对朝天椒盐胁迫下幼苗MDA、过氧化氢和超氧阴离子含量的影响Fig.8 Effects of different melatonin-soaked concentrations on MDA, hydrogen peroxide and superoxide anion contents of pepper seedlings under salt stress

柱形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图9 褪黑素种子引发处理对朝天椒盐胁迫下幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响Fig.9 Effects of different melatonin-soaked concentrations on soluble sugar, soluble protein and proline contents of pepper seedlings under salt stress

柱形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图10 褪黑素种子引发处理对朝天椒盐胁迫下幼苗SOD、POD和CAT活性的影响Fig.10 Effects of different melatonin-soaked concentrations on superoxide dismutase (SOD), POD and CAT activities of pepper seedlings under salt stress

柱形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK见图1注。图11 褪黑素种子引发处理对朝天椒盐胁迫下幼苗APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值的影响Fig.11 Effects of different melatonin-soaked concentrations on APX activity, AsA content, DHA content and AsA/DHA value of pepper seedlings under salt stress

3 讨论

3.1 不同浓度褪黑素引发处理对盐胁迫下朝天椒种子萌发的影响

种子萌发不仅代表着植物生命的开始，更是植物生活史耐盐性最差的阶段，其发芽率与植物耐盐碱能力密切相关。本研究结果表明，100 μmol/L的褪黑素种子引发处理可最大程度促进盐胁迫下朝天椒种子的萌发和幼苗生长；较高浓度(150 μmol/L、200 μmol/L)的褪黑素引发处理则会对种子在盐胁迫下的萌发产生不利影响，这与刘佳奇等[32]发现NaCl胁迫下，褪黑素种子引发处理能够明显促进小麦种子萌发的结果一致。100 μmol/L的褪黑素种子引发处理促进盐胁迫下的朝天椒种子萌发的原因可能是褪黑素引发处理促进了种子内抗氧化酶(POD、CAT、APX)活性、SS、SP、Pro和抗坏血酸含量的升高，并降低了种子内丙二醛和过氧化氢的含量，从而促进了种子的活力，并为种子萌发提供了能量[33]。高浓度(150 μmol/L、200 μmol/L)褪黑素引发处理后，反而增加了种子丙二醛和ROS含量并降低了抗氧化酶活性，表明其导致了种子细胞膜系统的损伤，降低了种子的氧自由基清除能力。

3.2 不同浓度褪黑素引发处理对盐胁迫下朝天椒幼苗生长的影响

当植物受到盐胁迫时，植物细胞失水，细胞壁破裂，甚至死亡[13]。本研究结果表明，100 μmol/L褪黑素引发处理后，盐胁迫下幼苗的植株全长、根长、鲜质量和干质量显著增加，说明100 μmol/L褪黑素引发处理能够促进幼苗生物量的积累以及植株发育；25 μmol/L褪黑素引发处理后，盐胁迫下幼苗的根长/株高值显著增加，说明25μmol/L褪黑素引发处理能够促进幼苗根系的发育。与陈莉等[13]发现低浓度褪黑素引发处理棉花种子可以显著提高幼苗生物量及胚根长；与蒋航等[34]研究发现褪黑素可以抵抗砷的毒害提高水稻根长和芽长的结果一致。

当植物受到胁迫时，植物体内氧代谢失调，导致各种膜结构受到过量ROS的破坏，形成氧化胁迫[35-37]。本研究结果表明，100 μmol/L褪黑素引发处理后，盐胁迫下幼苗的丙二醛和ROS含量显著降低，渗透调节物质含量和抗氧化酶(SOD和POD)的活性显著增加；75～125 μmol/L褪黑素引发处理后CAT显著增加，说明75～125 μmol/L褪黑素引发处理能缓解盐胁迫造成的细胞过氧化伤害，从而提高幼苗的耐盐性。这与郭惊涛等[38]用褪黑素引发处理萝卜种子来提高幼苗渗透调节物质和抗氧化酶活性去促进幼苗生长和银珊珊等[39]使用褪黑素引发处理黄瓜种子提高幼苗渗透调节物质并降低丙二醛和ROS含量来抵抗干旱胁迫的研究结果一致。AsA可以在APX作用下与 H2O2反应生成 H2O，清除H2O2的毒性[40]。本研究结果表明，100 μmol/L褪黑素引发处理后，盐胁迫下幼苗的APX活性及AsA、DHA 含量和AsA/DHA值都显著增加，说明100 μmol/L褪黑素引发处理能提高朝天椒幼苗中AsA的产生速率，提高AsA/DHA值，增强朝天椒幼苗抗盐胁迫的能力。这与李富宏[41]发现喷施褪黑素能通过提高抗坏血酸过氧化物酶活性和抗坏血酸等含量提高幼苗耐盐性研究结果一致。