传统插片法接种方法的改进与应用

郑菲菲 吴志新 李莉娟 黎洁 祝东梅

摘 要：放线菌的形态结构观察是水产微生物学实验课程的重要实验之一，实验教学中一直采用压片浸染法和印片浸染法观察放线菌的形态结构，但观察效果不好。采用插片浸染法后，学生通过简单操作即可清晰地观察到完整自然的基内菌丝、气生菌丝和分生孢子形态。传统插片法接种操作不方便，接种时间长，效率低;改进后的接种方法不仅操作简单方便省时，而且还大大提高了实验教学的效果，激发了学生探索微观世界的兴趣。

关键词：放线菌;插片法;接种;形态结构观察

中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章編号 1007-7731（2022）01-0138-02

水产微生物学实验是水产养殖和水族科学与技术专业重要的专业基础必修课。通过课程的学习，学生不仅可以强化和巩固对微生物理论知识的理解和认知[1]，还可以掌握从事微生物学及生物学研究的基本方法和技术。放线菌的形态结构观察是实验课中重要的实验内容，以前实验教学一直采用压片浸染法和印片浸染法来进行观察，很难清晰地观察到放线菌的形态和结构，远远无法达到预期的实验教学效果。因此，亟需对实验方法进行改进和创新。

探寻一种更简单有效的方法非常必要。蔡信之[2]在1995年就提出采用插片法观察放线菌的形态比印片法和涂片法效果更好，可以观察到放线菌的基内菌丝（营养菌丝）、气生菌丝和分生孢子的完整自然形态。汪红等[3]又提出插片结合浸染法可以增加放线菌菌丝和孢子与背景的反差，从而提高放线菌形态观察的效果并增加实验的趣味性，并且插片浸染法凭借其优势还在放线菌的筛选鉴定和扫描电镜样品的制备中得到广泛应用[4-7]。但是传统的插片法接种时是先将无菌的盖玻片以约60°角度插入平板培养基上，再用接种环取孢子接种于盖玻片与培养基内侧基部结合处[3]，这种方法接种慢、难度大。因此，本研究在此传统插片法接种方法上进行了改进，采用先接种后插片的方法，大大降低了实验准备的操作难度并提高了工作效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 华中农业大学水产学院水产养殖国家级实验教学示范中心保存的紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaceorectus）。

1.1.2 培养基 无机盐淀粉琼脂培养基[6]：可溶性淀粉 10g/L，（NH4）2SO4 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4 1g/L，NaCl 1g/L，CaCO3 3g/L，琼脂1.5%。pH7.0～7.5，1×105Pa高压蒸汽灭菌20min。

1.1.3 染色液 溶液A：碱性复红（碱性品红）0.3g，酒精（95%）10mL，用研钵研磨;溶液B：石碳酸5g、蒸馏水95mL。将溶液A及溶液B进行混合即成石碳酸复红原液，将原液稀释5倍用于染色。

1.1.4 无菌盖玻片 为了方便插片时取片，将25mm×25mm盖玻片洗净后单层平放于铺有滤纸的灭菌盒中，铺满盖玻片后再放1层滤纸，然后继续铺1层盖玻片，以此类推，铺好后高压蒸汽灭菌20min，灭菌结束后置于干燥箱中60℃烘干备用。

1.2 试验方法

1.2.1 放线菌的培养 倒平板：将灭菌之后的无机盐淀粉琼脂培养基融化后倒入直径70mm的无菌培养皿，每个25mL左右，水平放置至凝固，制成厚度约5cm的平板培养基，比正常的培养基要厚，这样盖玻片与培养基的接触面积就会变大。接种：接种环灭菌后挑取适量紫色直丝链霉菌孢子在平板上先从中间横向接种，然后旋转平板与其垂直方向均匀密实之字划线（见图1），以方便后面插片操作。与之前的先插片后接种相比，采用先接种后插片的操作方法可以在相同的平皿相同时间内中做更多的插片，并且接种的操作较之前也更方便。插片：镊子灼烧灭菌冷却后夹取无菌盖玻片横跨划线线条以与培养基成30°～45°夹角插入固体培养基中（见图1），夹角不宜过大，否则培养皿盖子无法盖好。插片数量按需而定，一般直径70mm的平皿可以插25mm×25mm盖玻片8～10片。插片结束后倒置于28℃培养箱培养4～5d，以满足实验教学要求。

1.2.2 放线菌的染色和镜检 取片：用镊子小心夹取菌片，除去多余的培养基，操作过程中动作要轻，以免破坏菌片。浸染：将菌片以一定的角度慢慢放在滴有石碳酸复红染液的载玻片上（避免产生气泡）浸染1min左右。镜检：用吸水纸将盖玻片上多余的染液吸干净，然后在显微镜下进行观察并拍照。

2 结果与分析

压片浸染法是用镊子夹取菌落边缘放在染液里再用镊子进行压片，由于缺乏经验，力度难以控制和取样方法不好，导致在显微镜下观察到的菌丝层叠在一起，很难分辨清楚基内菌丝和气生菌丝。印片浸染法则只能看到孢子丝和孢子的形态，偶尔可以观察到气生菌丝（表1）。而采用改进之后的插片浸染法能够发现菌丝体和孢子图像背景层次分明、结构清晰。由图2可知，紫色直丝链霉菌是由分枝状菌丝组成，并且能很好地区分营养菌丝、气生菌丝和孢子。基内菌丝着色淡、无隔膜、不断裂、波曲状;气生菌丝同样无隔膜、不断裂、波曲状，但着色较深，且比基内菌丝粗;当气生菌丝发育到一定程度，其顶端可分化形成孢子丝（繁殖菌丝）;孢子成熟后通过横割分裂的方式产生成串的分生孢子，孢子为椭圆形或短杆状。

3 结论

本研究结果表明，采用改进的插片接种方法较传统接种方法有更多优点。连续3年采用改进的插片浸染法进行放线菌形态结构观察，老师和学生均反映改进的插片浸染法优于之前的压片浸染法和印片浸染法，实验效果好、成功率高、节约时间，并且可以激发学生探索微观世界的兴趣，提高教学效率和效果。

参考文献

[1]谭凤霞，彭本英，罗静波.水产微生物学实验教学体系的构建与实践[J].长江大学学报（自然版），2011（8）：270-272.

[2]蔡信之.插片法观察放线菌霉菌效果好[J].实验教学与仪器，1995（2）：28.

[3]汪红，解丽芳，王甜，等.用浸染法提高放线菌形态观察的效果[J].西华师范大学学报（自然科学版），2011（3）：256-258.

[4]刘华松，陈羽，戴伟巧，等.1株产α-糖苷酶抑制剂放线菌的筛选与鉴定[J].微生物学杂志，2017（2）：58-61.

[5]涂璇，黄丽丽，高小宁，等.黄瓜内生放线菌的分离、筛选及其活性菌株鉴定[J].植物病理学报，2008（3）：244-251.

[6]李应祥，王为镇，谈孝凤，等.茶云纹叶枯病拮抗放线菌的筛选[J].安徽农业科学，2014（32）：11339-11341.

[7]杨瑞，王歧，张露，等.放线菌扫描电镜样品制备方法比较研究[J].电子显微学报，2014（1）：84-89.

（责编：徐世红）