2型糖尿病对患者精子DNA碎片率、AR和MMP的影响研究

张军荣 徐惠明 唐锋 奚颖霞

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）是一种多发病、常见病，流行病学调查显示其患病率逐年上升，严重影响人们的身心健康[1-2]。研究发现T2DM的慢性高血糖状态会造成患者多器官功能损害，并且对生殖功能也可能有潜在的不利影响[3]。随着男性T2DM患者的增加，潜在的生育风险也越来越大，故而研究T2DM影响男性生育能力的可能途径已经是迫在眉睫[4-5]。因此，本研究探讨T2DM对患者精子DNA碎片率、精子顶体反应（acrosome reaction,AR）率和精子线粒体膜电位（mitochondrial membrane protential,MMP）的影响，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年1月至2021年12月浙江省妇幼和生殖保健中心收治的T2DM育龄男性患者50例作为研究对象（T2DM组），年龄22～40（28.31±4.32）岁；体重57～89（68.74±7.42）kg。纳入标准：（1）符合《中国2型糖尿病防治指南（2017年版）》[6]中T2DM诊断标准，且均为育龄男性；（2）初次发现、尚未经治疗；（3）年龄≥20岁。排除标准：（1）伴糖尿病并发症；（2）伴急性感染、恶性肿瘤等疾病者；（3）严重精神疾病者；（4）伴严重肝、肾、脾、心、肺等严重异常者；（5）伴其他影响精液治疗的内分泌疾病；（6）存在射精障碍、勃起功能障碍者；（7）遗传性疾病、泌尿生殖系统异常者。另选取同期本中心健康体检育龄男性55名作为对照组，年龄 22～40（28.63±4.27）岁 ；体重 54～85（68.35±6.85）kg。两组受试者年龄和体重比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 主要试剂 精子DNA碎片染色试剂盒、精子AR检测试剂盒、精子MMP检测试剂盒均购自青岛复诺生物医疗有限公司。

1.3 方法

1.3.1 精液标本采集 禁欲3～7 d以手淫法收集受试者精液标本。

1.3.2 正常形态精子百分比、精子浓度和前向运动精子百分比检测 精液标本完全液化后按《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第5版进行常规分析，检测正常形态精子百分比、精子浓度和前向运动精子百分比。

1.3.3 精子DNA碎片率测定 精液标本完全液化后，加入A液调整精子浓度至（1～2）×106/ml，将待染色精液样本及染色试剂均放置于冰盒上预冷5 min。取100 μl准备好的待检精液样本置于15 ml EP管中，加入B液200 μl，混匀，反应30 s后加入C液600 μl，立即混匀。将混匀的溶液置于流式细胞仪上样管处，使用流式细胞仪测定精子DNA碎片率。

1.3.4 精子AR率测定 精液标本完全液化后，在显微镜下观察计数，根据精子浓度取20～40万个精子，加入A液稀释至1 000 μl，混匀。将待染色精液样本及试剂盒中的染色试剂放置于金属浴上37℃预热5 min。吸取D液，加入上述A液稀释混匀的样本中，混匀3 s。分别取500 μl准备好的待检精液样本置于1.5 ml离心管中，标记为检测管、对照管。分别吸取B液5 μl加入检测管、C液5 μl加入对照管，混匀3 s，金属浴上37℃静置15 min，使用流式细胞仪测定精子AR率。

1.3.5 精子MMP测定 精液标本完全液化后，在显微镜下观察计数，根据精子浓度取10～20万个精子，加入A液稀释至500 μl，混匀。将待染色精液样本以及试剂盒中的染色试剂放置于金属浴上37℃预热5 min。将待染色样本加入1.5 ml离心管中，混匀10 s。吸取B液5 μl，加入上述离心管中，混匀3 s，于37℃金属浴上静置10 min，使用流式细胞仪测定精子MMP。

1.4 统计学处理 采用SPSS 25.0软件处理。计量资料以±s表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组正常形态精子百分比、精子浓度和前向运动精子百分比比较 T2DM组正常形态精子百分比、精子浓度和前向运动精子百分比均低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 两组正常形态精子百分比、精子浓度和前向运动精子百分比比较

2.2 两组精子DNA碎片率、AR率和MMP比较 T2DM组精子DNA碎片率高于对照组，精子AR率、精子MMP均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组精子DNA碎片率、AR率和MMP比较（%）

3 讨论

近年来，研究发现T2DM可能引起男性生育能力下降[7-10]。精液质量是男性生育能力体现的一个重要指标。T2DM导致男性激素水平失常，生精功能障碍间接或直接造成精子相应的正常生理过程受干扰；并且又最直接得造成附睾、睾丸组织正常功能受限，主要包括精子活力下降、精液液化时间延长及精子总数减少，因此会造成男性生育能力减弱，甚至可能出现不育的情况[11-13]。本研究表明，T2DM组正常形态精子百分比、精子浓度、前向运动精子百分比均低于对照组，提示T2DM患者正常形态精子百分比、精子浓度和前向运动精子百分比均下降。近年来，以精子DNA损伤为特征的精子染色体结构异常可能对男性生育能力具有一定预测价值[14]。本研究表明，T2DM组精子DNA碎片率高于对照组，提示T2DM患者精子DNA碎片率明显增加。精子顶体主要由高尔基体小泡发育而来，并且是精子头部顶端特化的小泡。而AR主要指精子在输卵管壶腹部与卵子相遇后，导致顶体产生一系列反应[15-16]。精子AR率是男性精子受精能力的判断指标[17]。姚佳沛[18]研究表明，与正常人群相比，糖尿病患者（a+b）级精子减少、精液液化时间延长、精液量减少。本研究表明，T2DM组精子AR率低于对照组，提示T2DM患者精子AR率明显降低。线粒体是细胞产生活性氧的主要部位，故而线粒体DNA、基质中的酶最易受到活性氧攻击的损伤[19]。线粒体正常膜电位依赖于线粒体膜间隙和线粒体基质内的质子泵，当线粒体内活性氧过度增加时，则会导致MMP下降[20]。本研究表明，T2DM组精子MMP低于对照组，提示T2DM患者精子MMP明显下降。

综上所述，T2DM患者精子DNA碎片率升高、精子AR率和精子MMP下降，可能影响T2DM患者生育能力，导致生育能力下降。T2DM对精子DNA碎片率、AR率及MMP的影响机制仍不明确，笔者团队将对此开展进一步研究。