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轮状病毒感染对乳鼠肠道菌群及小肠屏障功能的影响

2022-02-04陆恒章于美玲程美慧刘洋刘长城赵微

中国医科大学学报 2022年12期
关键词:乳鼠拷贝数轮状病毒

陆恒章,于美玲,程美慧,刘洋,刘长城,赵微

(锦州医科大学基础医学院实验动物教研室,辽宁 锦州 121000)

轮状病毒是一种双链RNA病毒,属于呼肠弧病毒属(Reoviridae),是婴幼儿腹泻的主要病因[1]。肠道病毒感染能够导致宿主的肠道黏膜屏障功能破坏,改变肠道通透性,从而造成腹泻症状;肠道病毒感染也可改变肠道微生物的组成和活性,如脊髓灰质炎病毒[2]、呼肠孤病毒[3]、诺如病毒[4]和鼠轮状病毒[5],可影响肠道微生物群落,导致宿主腹泻。肠道菌群的改变主要表现为厌氧菌的减少、需氧菌的相对增多及肠道微生物多样性显著降低[6-7]。

本研究拟通过16S rDNA测序法检测乳鼠感染轮状病毒后肠道菌群的组成、微生物差异性及菌群特征,通过实时荧光定量PCR检测乳鼠腹泻模型肠道黏膜屏障功能相关基因的表达及肠道通透性的改变,从而探讨轮状病毒感染后肠道菌群结构的改变与肠道黏膜屏障功能的关系。为进一步了解肠道菌群与轮状病毒感染之间的相互作用,预防和治疗轮状病毒感染提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级昆明系小鼠由锦州医科大学实验动物中心提供(ScXK[辽]2019-0003)。饲养在SPF级动物实验室内,自由饮食水,环境温度22.2 ℃,湿度40%~70%,12 h光暗循环(SYxK[辽]2019-0007)。所有操作均符合锦州医科大学实验动物伦理委员会的实验动物伦理要求(审批号:2019014)。

轮状病毒SA11株由锦州医科大学病原生物学教研室提供。TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司,PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)购 自大连TaKaRa公司;异硫氰酸荧光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-dextran)购自美 国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 轮状病毒感染乳鼠腹泻模型的建立:采用清洁级昆明系小鼠10窝,同窝繁育,每窝饲养雌性6只和雄性1只,合笼21 d后随机获得乳鼠20窝(乳鼠雌雄不拒),将20窝乳鼠随机分为为轮状病毒感染(RV)组与对照(NC)组,10窝/组。每窝8~12只乳鼠与1只哺乳期母鼠饲养于单独通风的IVC笼中。乳鼠5日龄时体质量约为8~9 g。乳鼠出生后第1天记为1日龄。待乳鼠4~5日龄后开始实验。实验组每天每只乳鼠灌胃1×107病毒感染荧光灶个数(fluorescent focus unit,FFU)/mL的SA11株轮状病毒100 μL;对照组每天每只乳鼠灌胃PBS 100 μL,连续灌胃4 d,每天观察乳鼠排便情况。

1.2.2 实验动物的处理及样品的收集与保存:所有乳鼠连续灌胃4 d后(即实验组出现最严重腹泻症状时间点)实施颈椎脱臼法处死,在超净工作台中,用高压灭菌的手术器械收集结肠和直肠的混合肠道内容物以及结肠和直肠组织,置于无菌EP管中,立即置于-80 ℃冻存。

1.2.3 乳鼠粪便DNA提取和PCR扩增:根据QIAamp粪便DNA迷你提取试剂盒(美国Qiagen公司)说明书操作,从混合肠道内容物中提取基因组DNA。利用引物341F(5’ -CCTACGGGRSGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’)扩增细菌16s核糖体RNA基因(342F和806R)V3~V4区。PCR程序为:95 ℃3 min,98 ℃20 s,58 ℃15 s,72 ℃20 s,30个循环,72 ℃延长5 min。PCR反应体系为:2×KAPA Library Amplification ReadyMix 15 μL,上下游引物各1 μL,模板DNA 50 ng,加ddH2O至总体积30 μL。2 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(美国AXYGEN公司)切胶回收PCR产物。利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和2%琼脂糖凝胶电泳进行文库质检。

1.2.4 16S rDNA测序及关联分析:16S rDNA PCR扩增区域为V3~V4区,采用通用引物341F和806R进行PCR扩增。PCR扩增后进行文库质检、Qubit进行文库定量。使用Illumina Miseq PE250进行测序分析。获得的测序数据进行物种分类和丰度分析,以及α多样性分析、β多样性分析。使用LEfSe在属水平上选择差异物种,行Spearman相关性分析,绘制差异物种与检测因子的相关性热图。

1.2.5 乳鼠结直肠粪便RNA提取及cDNA合成:称取各组结肠和直肠组织0.1 g于1.5 mL离心管中,加入0.9 mL PBS缓冲液,加入5~10颗瓷珠后,置于珠式样品研磨器中研磨2 min。取250 mL组织研磨液于新的1.5 mL离心管中用于RNA提取。采用TRIzol法提取RNA,并反转录合成cDNA,-20 ℃保存。反转录反应体系:RNA提取液10 μL,PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 μL,Gene Specific Primer 5 pmol,5×PrimeScript Buffer 4 μL,加ddH2O至总体积为20 μL,42 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。

1.2.6 实时荧光定量PCR测定病毒基因拷贝数及紧密连接蛋白基因的表达:

1.2.6.1 病毒基因拷贝数检测 扩增SA11衣壳蛋白VP6特异性基因并绘制标准曲线VP6基因引物序列如表1所示。扩增产物164 bp。扩增产物纯化回收,构建标准质粒,检测标准质粒浓度为290.5 ng/μL。10倍梯度稀释标准品质粒,每个样品重复3次,以Ct值为横坐标,lg基因拷贝数为纵坐标,绘制标准曲线。计算标准质粒DNA基因拷贝数(copies/mL)=6.02×1023/mol×质粒浓度(g/mL)/分子量(MWg/mol)。

表1 PCR引物Tab.1 Primer sequences

1.2.6.2 紧密连接蛋白基因表达检测 根据小鼠肠道细胞紧密连接蛋白1(tight junction protein 1,TJP-1)、紧密连接蛋白4(claudin-4)、连接黏附分子(F11 receptor,F11R)基因设计特异性引物,以小鼠Gapdh为内参基因,引物序列见表1。实时荧光定量PCR的具体步骤按照TB Green® Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)说明书操作,设3组重复。根据溶解曲线的结果判断设计的引物是否可行,采用2-ΔΔCt计算相对定量。

1.2.7 乳鼠肠道通透性检测:连续灌胃4 d后,NC组和RV组各取2~3只乳鼠于单独笼中断食8~10 h后,分别给乳鼠灌胃FITC-dextran 0.6 mg/g,6 h后麻醉,将乳鼠置于动物活体成像仪中,在激发波长485 nm、发射波长535 nm下观察乳鼠肠道通透性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析,数据以±s表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用最小显著性差异法(least-significant difference,LSD)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 轮状病毒感染乳鼠腹泻模型检测

连续灌胃4 d后,可观察到RV组乳鼠水样腹泻,粪便呈黄色;而NC组乳鼠无腹泻。实时荧光定量PCR检测结果如表2、图1所示,RV组轮状病毒SA11毒株VP6基因的拷贝数于感染第4天达顶峰(1.32×109copies/mL)。

图1 轮状病毒感染后1~7 d乳鼠粪便样本中轮状病毒拷贝数Fig.1 Copy number of rotavirus in stool samples 1 to 7 days after rotavirus infection

表2 病毒拷贝数Tab.2 Number of virus copies

2.2 乳鼠肠道内容物16S rDNA测序分析

2.2.1 α多样性指数分析和β多样性分析:在Illumina MiSeq PE250平台上运行并按方法进行质量过滤后,所有样本共生成1 182 607条reads,根据Alpha多样性分析,兼顾测序饱和度和样品完整性,对每个样品随机抽取47 504条reads。根据各样本的操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)计数,对样本序列多样性和丰富度进行评价,NC组与RV组实际观测到的OTU数量用observed_species指数比较,2组的OTU数量存在统计学差异(P=0.034),见图2A。为了比较2组细菌群落组成的差异,利用Adonis分析微生物群落结构的差异。采用Unweighted_UniFrac未加权比较2组肠道内容物细菌组成,结果如图2B所示,2组有明显的分离(Adonis检验P=0.001,R2=0.192)。RV组与NC组的细菌组成有显著差异。

图2 组间α多样性分析和β多样性分析Fig.2 α diversity analysis and β diversity analysis between groups

2.2.2 物种分类与相对丰度分析和显著性差异分析:根据物种注释结果,在属水平对样品内的丰度进行分析,结果如图3A所示,与NC组相比,RV组乳酸杆菌(Lactobacillus)丰度(36.29%)、幽门螺杆菌(Helicobacter)丰度(0%)、梭杆菌(Fusobacterium)丰度(4.74%)均减少,志贺氏菌(Shigella)丰度(43.48%)增加。在属水平上对所有物种进行分析,如表3所示,未发现未通过P值筛选的物种,经Wilcoxon秩和检验,RV组与NC组间有10个属存在明显差异。2组之间属水平的显著差异如图3所示,NC组的优势属为Lactobacillus、Paenibacillus、Brevundimonas、Parabacteroides、Bacteroides和Alloprevotella,而RV组的富集属为Enterococcus和Shigella。

图3 样品组成多样性分析及显著性差异分析Fig.3 Analysis of sample composition diversity and significant difference

表3 乳鼠RV感染后的差异性菌属Tab.3 Differential bacteria genera after RV infection in suckling mice

2.3 RV感染后乳鼠TJP-1、claudin-4和F11R基因表达情况

实时荧光定量PCR检测结果显示,与NC组相比,RV组claudin-4基因相对表达量(5.41±0.47)增加了448%(P< 0.001)、F11R基因(4.46±1.44)增加了541%(P< 0.001),而TJP-1基因(0.46±0.08)降低了56%(P< 0.001),表明轮状病毒感染后乳鼠肠道黏膜屏障功能发生了改变。

2.4 Spearman相关性分析

Spearman与检测因子的相关性分析结果如图4所示,F11R基因的表达与短单胞菌属和拟杆菌属呈负相关;claudin-4基因的表达与短单胞菌属呈负相关;TJP-1基因的表达与短单胞菌属呈正相关。

图4 差异物种与检测因子的相关性分析Fig.4 Correlation analysis between different species and detection factors

2.5 乳鼠肠道通透性变化

如图5所示,RV组肠通透性明显增加,FITC-dextran通过肠上皮细胞进入血液,导致乳鼠肠道外的部位出现荧光,NC组FITC-dextran则无法通过肠上皮而聚集在肠道中。

图5 动物活体成像仪下观察肠道通透性荧光图Fig.5 Fluorescence image of intestinal permeability observed by in vivo animal imager

3 讨论

轮状病毒是引起儿童腹泻最常见的病原体,肠道病毒进入人体后会先与微生物群接触,故微生物群的组成可能影响轮状病毒感染[8]。研究[9-10]显示,感染了轮状病毒的婴儿肠道微生物多样性低于健康儿童。关于肠道微生物组成与轮状病毒之间的相互作用关系的研究仍然比较少。本研究结果显示,轮状病毒感染组乳鼠肠道菌群多样性低于NC组,因此,推测肠道微生物群在腹泻相关过程中发挥了重要作用。

紧密连接主要位于上皮细胞顶端表面,是上皮细胞间连接最为重要的结构复合物,在维持肠黏膜的屏障功能方面发挥重要作用[11]。目前有多种蛋白已经被证实参与了紧密连接的形成,包括claudin、TJP、OCLN、F11R和ZO家族。紧密连接蛋白常被用作观察肠道紧密连接屏障功能和通透性的指标[12]。本研究中,轮状病毒感染后,乳鼠TJP-1基因的表达显著下降。TJP-1作为调控细胞紧密连接的关键因子,具有连接细胞间屏障和调节肌动蛋白的作用,可增强细胞间连接[13]。TJP-1低表达可破坏细胞的紧密连接,导致病原体和其他物质进入肠腔引起腹泻[14]。本研究还发现,短单胞菌属的多样性与TJP-1的表达具有显著的相关性。研究[15-16]表明,短单胞菌属会在宿主免疫功能降低时作为机会病原体感染宿主,提示可能是轮状病毒感染影响了乳鼠TJP-1的表达,导致短单胞菌属多样性增加。

claudin-4是紧密连接蛋白家族成员之一,参与保持正常组织细胞之间的紧密连接。claudin-4蛋白在细胞膜表面异常表达,可能引起细胞极性破坏,细胞间的连接变松散,细胞间黏附力下降[17],进而破坏肠道屏障功能。而F11R基因编码F11受体蛋白,也称连接黏附因子(iunctional adhesion molecule,JAM-A),是免疫球蛋白超家族成员,是参与细胞紧密连接的跨膜蛋白,通过调节上皮通透性、炎症和增殖来维持肠道内环境的动态平衡[18]。有研究[19]表明,呼肠孤病毒能通过F11R进入感染内皮细胞,从而增强呼肠孤病毒的传播。同样,本研究发现轮状病毒感染后乳鼠claudin-4和F11R基因表达水平显著升高,表明claudin-4和F11R表达的增加可能会影响肠道黏膜屏障的功能,但目前这2个基因对肠道黏膜屏障功能的具体作用还存在争论,需要进一步的研究探索。本研究通过Spearman相关性分析发现,短单胞菌属及拟杆菌属的多样性与claudin-4和F11R表达的增加呈负相关,表明这2种基因表达可能还影响了短单胞菌属和拟杆菌属的多样性。

综上所述,本研究发现了轮状病毒感染前后乳鼠肠道内10种显著差异菌属,检测了改变肠道黏膜屏障功能相关基因TJP-1、claudin-4和F11R的表达变化情况。并发现短单胞菌属和拟杆菌属与TJP-1、claudin-4和F11R的表达存在一定的相关性。通过对病毒感染后肠道微生物群落的深入挖掘,对轮状病毒微生态制剂的研发及临床应用、辅助临床腹泻的预防和治疗具有一定意义。同时深度剖析影响病毒复制的肠道共生菌,为筛选诊治病毒感染的靶点提供了新的思路。

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